论文摘要
背景:骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）是骨髓造血微环境的主要组成部分,通过介导造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSC）粘附和分泌多种造血生长因子而发挥造血支持的作用。其中干细胞生长因子（stem cell factor,SCF）不但能够刺激原始造血细胞增殖分化,还能在一定水平上反应骨髓基质的造血调控作用。同时骨髓MSC还具有免疫抑制作用,肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）和转化生长因子-β1 （transforming growth factor, TGF-β1）是骨髓MSC发挥免疫抑制作用的效应因子。再生障碍性贫血（aplastic anemia, AA,再障）是以外周血全血细胞减少和骨髓增生不良为主要特征的疾病,是小儿时期较多见的一种贫血性疾病,其发病机制主要涉及免疫功能紊乱、造血微环境异常和造血干祖细胞破坏。目的:体外分离、培养骨髓MSC,研究再障患儿骨髓MSC的造血支持作用和免疫抑制作用。方法:采集24例再障患儿和20例对照的骨髓标本,分离、培养和扩增MSC,进行细胞形态观察及增殖能力检测,对骨髓MSC进行成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）分析;应用MTT法检测骨髓MSC黏附造血细胞的能力;采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测骨髓MSC细胞培养上清中SCF的浓度;对骨髓MSC进行贴壁培养,接种骨髓单个核细胞（mononuclear cell,MNC）,观察扩增细胞数和扩增后MNC形成的BFU-E、CFU-GM、CFU-GMME;采用混合淋巴细胞反应（MLR）检测骨髓MSC对淋巴细胞的免疫抑制能力;采用RT-PCR半定量分析骨髓MSC细胞内TGF-β1和HGF mRNA的表达水平;采用ELISA检测骨髓MSC细胞培养上清中TGF-β1和HGF的浓度。结果:1.再障患儿骨髓MSC呈现典型的成纤维细胞形态,三代以前与对照相似;再障患儿骨髓MSC第一代与第三代的传代时间延长,CFU-F计数（15.70±5.78）显著低于对照组骨髓MSC的CFU-F计数（21.73±5.74）,t=-2.94,P<0.05;2.再障患儿骨髓MSC对造血细胞的黏附率[ （59.65±15.52）%]较对照组黏附率[ （68.18±15.53）% ]无显著差异,t=-1.48,P>0.05;3.再障患儿骨髓MSC培养上清中SCF的浓度[（30.69±16.82） pg/ml]显著低于对照组骨髓MSC培养上清中SCF的浓度[（50.74±14.83） pg/ml],t=-3.28,P<0.01;4.再障患儿骨髓MSC支持下的MNC细胞扩增总数和扩增后MNC的集落形成能力,BFU-E、CFU-GM、CFU-GMME计数[（1.35±0.32）×106 ,（61.88±10.32）,（122.88±14.76）,（5.41±2.81）]显著低于对照组[（1.70±0.29）×106,（87.00±10.95）,（160.00±24.02）,（9.33±3.08）],P<0.01;5.再障患儿骨髓MSC免疫抑制率[（49.78±20.36）%]显著低于对照组骨髓MSC免疫抑制率[（76.42±8.80）%],t=-4.56,P<0.01;6.再障患儿骨髓MSC细胞中TGF-β1 mRNA的表达显著低于对照,t=-4.14,P<0.01;HGF mRNA的表达显著低于对照,t=-2.86,P<0.05;7.再障患儿骨髓MSC培养上清中TGF-β1的浓度[（415.09±108.10）pg/ml]显著低于对照组骨髓MSC培养上清中的浓度[（630.00±115.85）pg/ml],t=2.83,P<0.01;再障患儿骨髓MSC培养上清中HGF的浓度[（340.72±40.44）pg/ml]显著低于对照组骨髓MSC培养上清中HGF的浓度[（518.12±32.00）pg/ml ],t=-3.02,P<0.01。结论:1.再障患儿骨髓MSC体外造血支持作用较对照组骨髓MSC显著降低,其发生机制可能与再障患儿骨髓MSC增殖能力减低和分泌SCF减少有关;2.再障患儿骨髓MSC的免疫抑制作用较对照组骨髓MSC显著降低,其发生机制可能与再障患儿骨髓MSC增殖能力减低、表达和分泌TGF-β1、HGF减少有关,与再障的免疫发病过程密切相关。
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