论文摘要
大豆是既是我国主要的粮食作物,又是主要的油料作物,具有极高的营养价值,是人类食物和动物养殖的主要植物蛋白来源。但是,大豆含有凝集素、脂氧化酶、胰蛋白酶抑制剂等营养抑制因子影响大豆品质。大豆脂肪氧化酶是大豆主要营养抑制因子之一。脂肪氧化酶（Lipoxygenase.简称Lox）是一种含非血红素铁的蛋白质,专一催化具有顺。顺1,4戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸加氧反应,生成具有共轭双键的脂肪酸氢过氧化物,再经裂解酶分解生成短碳链的醇、酮和醛类等挥发性物质,这些挥发性物质导致大豆及其制品产生豆腥昧,这其中最主要的腥味物质就是己醛和己醇。是影响大豆品质的主要原因之一。RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术是直接有效的人为控制基因表达的方法,可以封闭特定基因的表达,引起基因转录后沉默（post transcriptional genesilencing,PTGS）。所以,RNAi技术,在改良植物品质方面有极大的应用价值。种子特异型启动子可以控制外源基因在植物种子中高效表达,避免外源基因在植物的其它部位表达,减少对植物的不利影响。利用种子特异型启动子控制外源基因在种子中特异表达具有重要理论和实践意义。本项研究应用基因工程手段,克隆大豆脂肪氧化酶基因,同时采用种子特异型启动子构建RNAi表达载体。以期抑制大豆脂肪氧化酶基因的表达,最终降低脂肪氧化酶的含量。同时提高蛋白或油份含量,为大豆品质改良探索新途径。本研究取得如下结果:1.以大豆品种“吉农18”总RNA反转录获得的cDNA为模板,依据GenBanK中大豆脂肪氧化酶基因序列,克隆了大豆三种脂肪氧化酶基因（Lox1、Lox2、Lox3）中同源性最高部分357bp外显子片段,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增得到大豆脂肪氧化酶序列的保守序列,测序结果表明,该片段大小为357bp。将扩增的目的片段插入pMD18-T Vector克隆载体获得重组质粒。重组质粒经大肠杆菌转化后进行蓝白斑筛选,取阳性菌落的质粒进行PCR检测和酶切鉴定结果所得片段大小和目的片段一致。2.将重组质粒和植物表达载体pCAMBIA1301经限制性内切酶双酶切,通过T4 DNA连接酶,将大豆种子特异型启动子（本实验室张宇构建的带有种子特异型启动子的表达载体）、大豆脂肪氧化酶基因反义+正义片段、内含子片段插入到pCAMBIA1301中相应的多克隆位点中,构建RNAi表达载体pCAMBIA1301-LoxiRt。将该RNAi表达载体pCAMBIA1301-LoxiRt转入大肠杆菌感受态细胞中增殖培养后提取质粒。3.通过花粉管通道法将克隆的Lox基因RNAi表达载体导入大豆,获得T0代转化的籽粒,萌发后以单棵植株叶片的总DNA为模板,进行PCR扩增,结果从2棵植株中得到960bp的特异性扩增条带,而未转化的植株中无该片段的产生