转基因杨树的分子检测及抗逆性评价

论文摘要

杨树速生、种类繁多、分布广泛,是重要的经济树种和短轮伐期工业用材树种之一,在水土保持和维护生态平衡方面发挥着重要作用。但长期以来多以追求速生性为主要育种目标,造成培育的品种适应性和抗逆性较差,以致在我国广大的干旱、半干旱、盐碱荒地以及涝渍地区难以发挥其作用,制约了当地生态建设和经济的发展。而基因工程技术的发展,为短期内培育抗逆转基因杨树提供了可能。本文将抗干旱、耐盐碱及耐涝基因转入杨树,并对转基因植株进行了分子检测、温室抗逆性、苗圃生长性状、逆境生境生长表现等进行了评价,得到以下主要研究结果:1.转果聚糖蔗糖转移酶（SacB）基因银腺杂种杨（Populus alba×P.glandulosa）的分子检测及抗旱性评价。对53株转SacB基因银腺杂种杨抗性植株进行了Southern杂交、RT-PCR检测,结果显示有28株检测到阳性信号,表明该基因已整合到银腺杂种杨基因组中并得到表达。在此基础上,对转基因植株进行了温室干旱胁迫试验,结果表明,随着干旱胁迫时间的延长,对照植株出现叶片变黄和脱落等现象,而转基因株系叶片变得浓绿而厚重,受到的影响明显小于对照植株,在转基因株系内对干旱胁迫的抵抗能力也不同,其中T23、T72在生长量、生物量方面与对照相比差异达到显著水平。从SacB基因表达产物果聚糖含量的测定结果来看,在转基因株系的叶片中检测到了果聚糖的积累,而对照植株未检测到,这一结果初步表明可能由于果聚糖的积累提高了转基因银腺杂种杨的抗旱性。而后对移栽至苗圃的转基因株系进行了生长性状和光合参数的测定,结果表明,有5个转基因株系对于株高和地径性状均高于对照;叶间距、比叶重均超过未转化植株;同时转基因株系的水分利用效率也均高于对照植株。对内蒙古干旱区转基因杨树对比试验林生长量的观测结果表明,在测定的12个转基因株系中有9个在生长量上超过对照植株。以上研究初步表明SacB基因的导入可提高转基因银腺杂种杨的抗旱性,最终获得了抗旱性增强的转基因植株。2.转茉莉酸和乙烯应答元件结合因子（JERFs）基因银中杨（P.alba×P.berolinensis Dipple）的分子检测及耐盐性评价。对先前获得的18株转JERF基因的银中杨进行了DNA和RNA水平的分子检测,获得了13株整合并初步得到表达的银中杨植株。在此基础上,选择生长正常且表现较好的5个转化株系及对照进行了不同浓度的NaCl胁迫处理,结果发现,随着盐浓度的上升和处理时间的延长,转化株系和未转化植株在生长上均明显受到抑制,但转基因株系受抑制程度明显低于对照植株;同时转基因株系叶片内的脯氨酸和Na+含量升高而MDA含量下降,而未转化对照植株变化相反,说明由于JERFs基因在银中杨中的表达,促进了脯氨酸含量的提高并加强了细胞膜的稳定性,进而提高了转基因银中杨的耐盐能力。移栽到苗圃后对转基因植株生长量测定结果表明,转基因株系、株高和地径均超过对照植株。另外,转JERFs基因株系叶间距相对较小,比叶重得到了提高,水分利用效率明显高于对照植株。在滨海盐碱地区和内陆盐碱地区营建了转基因杨树的对比试验林,调查结果发现,在参试的8个转基因株系中有4个在成活率、生长量方面表现优于未转化植株。初步证实JERFs基因在银中杨中的表达提高了转基因植株的耐盐性。3.转透明颤菌血红蛋白（vgb）基因银腺杂种杨的分子检测及耐涝性评价。对73株转vgb基因银腺杂种杨抗性植株进行了分子生物学检测,获得了24株转化植株。温室持续淹水胁迫试验,发现未转化植株在淹水第2d时大部分叶片出现萎蔫,第4d后下部叶片脱落,第10d地上部分变黑直至死亡,死亡率达66.7%,而转基因株系死亡率均明显低于对照。同时在涝渍胁迫下转基因植株叶绿素含量降幅低于非转基因植株,生长受抑制程度低于未转化对照植株,说明在淹水胁迫下vgb基因的表达增强了银腺杂种杨叶绿素含量的积累,进而促进了转基因植株的生长,提高了转基因株系对淹水的忍受能力。在苗圃转基因株系生长性状测定表明,转基因株系株高、地径、叶间距、比叶重均高于对照植株。对湖南汨罗高降雨区转基因杨树对比试验林生长量测定结果表明,3个转基因株系株高、地径均超过对照植株。初步获得了耐涝的转vgb基因银腺杂种杨。上述研究通过对转SacB、JERFs、vgb基因杨树抗性植株进行分子检测及温室抗逆性、苗圃生长性状、逆境生境生长表现进行评价,获得了抗逆性得到明显改良的转基因杨树,建立了转基因杨树抗逆性评价体系,对我国干旱盐碱涝渍地区的环境建设和经济发展具有重要的理论意义和应用价值,也为其它树种抗逆性状的遗传改良奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 本文缩略词（Abbreviation）
• 目录
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 植物抗逆基因工程研究概况
• 1.1.1 抗旱相关基因的研究
• 1.1.2 耐盐相关基因的研究
• 1.1.3 耐涝相关基因的研究
• 1.2 杨树抗逆基因工程研究概况
• 1.2.1 杨树抗旱转基因育种
• 1.2.2 杨树耐盐转基因育种
• 1.2.3 杨树耐涝转基因育种
• 1.3 研究思路与技术路线
• 2 转JERFs基因银中杨的分子检测及耐盐性评价
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 PCR扩增
• 2.1.4 Southern杂交（同位素法）
• 2.1.5 RT-PCR扩增
• 2.1.6 盐胁迫下转基因植株生长性状观察及生理生化指标的鉴定
• 2.1.7 苗圃条件下转基因植株生物学性状观测
• 2.1.8 盐碱地环境下转基因植株生长情况观测
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 转JERFs基因银中杨的PCR检测
• 2.2.2 转JERFs基因银中杨的Southern印迹杂交
• 2.2.3 转JERFs基因银中杨的RT-PCR分析
• 2.2.4 温室不同盐胁迫对转JERFs基因银中杨的生长性状的影响
• 2.2.5 温室不同盐胁迫下转JERFs基因银中杨及对照的盐害指数
• 2.2.6 温室不同盐胁迫下转JERFs基因银中杨耐盐生理生化指标的鉴定
• 2.2.7 转JERFs基因银中杨苗圃生物学性状分析
• 2.2.8 转JERFs基因银中杨的盐碱地区生长量分析
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 3 转vgb基因银腺杂种杨的分子检测及耐涝性评价
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 转基因植株的PCR扩增
• 3.1.4 转基因植株Southern杂交（ECL法）
• 3.1.5 转基因植株RT-PCR扩增
• 3.1.6 温室淹水胁迫下转基因植株生长性状观察及生理指标的鉴定
• 3.1.7 转基因植株苗圃生物学性状测定
• 3.1.8 转基因植株涝渍地区生长量测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 转vgb基因银腺杂种杨的分子检测
• 3.2.2 温室涝渍胁迫对转vgb基因银腺杂种杨生长的影响
• 3.2.3 温室涝渍胁迫对转vgb基因银腺杂种杨生理指标的影响
• 3.2.4 转vgb基因银腺杂种杨苗圃生物学性状分析
• 3.2.5 转vgb基因银腺杂种杨湖南洞庭湖涝渍地区生长量分析
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 4 转SacB基因银腺杂种杨的分子检测及抗旱性评价
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 Southern点杂交及印迹杂交
• 4.1.4 RT-PCR检测
• 4.1.5 干旱胁迫下转基因植株生长性状调查及果聚糖含量测定
• 4.1.6 转基因植株苗圃生物学性状观测
• 4.1.7 转基因植株干旱地区生长量测定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 SacB基因在银腺杂种杨中的整合情况
• 4.2.2 SacB基因在银腺杂种杨中的表达情况
• 4.2.3 温室干旱胁迫对转SacB基因银腺杂种杨生长性状的影响
• 4.2.4 温室干旱胁迫对转SacB基因银腺杂种杨果聚糖含量的影响
• 4.2.5 转SacB基因银腺杂种杨苗圃生物学性状分析
• 4.2.6 转SacB基因银腺杂种杨内蒙达拉特旗干旱区生长量分析
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 5 结论及研究展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介
• 致谢