家蚕浓核病毒（中国株）的增殖动态和病毒结构蛋白研究

论文摘要

家蚕浓核病毒中国株是一种双生浓核病毒（bidensovirus）。其宿主感染后的病症与典型的家蚕浓核病毒（BmDNV-1伊那株）表现相似，病蚕软化，中肠的圆筒型细胞呈浓核症。该病毒的基因组中含有两种DNA分子（VD1，VD2），这两种核酸分子以单链（+VD1，-VD1，+VD2，-VD2）线型方式被分开包装在各自的衣壳蛋白中，成为四种病毒粒子，而且病毒自身编码DNA聚合酶。该病毒粒子结构完全不同于一般的浓核病毒。浓核病的危害在我国夏秋季养蚕业中时常发生。家蚕中有部分品种对该病毒表现完全抗性，这种抵抗性的机制尚不清楚。本研究一方面对敏感性家蚕品种（华八35）和抗性家蚕品种（秋丰d）的幼虫进行经口接种病毒。在接种后，从2小时到96小时分9个时间点，对中肠组织进行取样。以家蚕细胞质肌动蛋白A3（actin A3）基因作为参比基因，用来标定取样组织细胞数。针对VD1和VD2分别设计特异引物，用荧光定量PCR的方法分别检测各个时间点的样品中的病毒基因组VD1和VD2拷贝数，以查明病毒在不同感受性品种中感染过程。另一方面，通过凝胶电泳分离和质谱分析，对病毒的结构蛋白进行鉴定。结果表明：1．两种病毒粒子VD1和VD2在两种感受性宿主体内的复制都是同步的。无论是在感性还是在抗性宿主的中肠内，家蚕浓核病毒中国株的基因组VD1和VD2在各时间点拷贝数相近，表现出VD1和VD2是同步复制的，这种同步复制可能与它们共有的末端序列以及自身编码DNA聚合酶有关。2．病毒能够侵入抗性宿主的中肠细胞，并且能够缓慢的增殖。在敏感性宿主体内，病毒扩增到感染后的96小时达到平台期，病毒的拷贝数达到大约20万个；在抗性宿主体内到96小时，病毒的拷贝数为大约150～200个。检测结果说明病毒确实能够进入中肠细胞，并且病毒核酸能低水平的复制，只是病毒入侵产生的效应不足以影响宿主细胞的正常生理活动。浓核病毒中国株对家蚕的感染是一种慢性感染。家蚕对BmDNV的抗性是一种感染抵抗性，是一种带毒不发病的表现。3．在成熟离体的病毒粒子中VD1和VD2的数量不等。通过荧光定量PCR检测，病毒接种液中VD1、VD2的Ct值分别为9.38、9.67，经过标准曲线和稀释比例计算得病毒接种液中的病毒拷贝数分别为VD15.04×106拷贝／μL，VD2 6.43×106拷贝／μL。由此算得，在成熟离体的病毒粒子群体内VD1：VD2=1：1．284．采用浓核病毒的昆虫个体经口滴注的接种方法，使蚕体在1分钟内摄入足够量的病毒，常规接种方法要取食24小时。新方法缩短了接种时间，使得全部病毒粒子在同一时间进入蚕体，同一时间抵达中肠细胞，病毒在细胞内的基因表达和复制也是在同一起始时间。该接种方法使得在个体水平精确分析浓核病毒在细胞中的复制成为可能。5．通过凝胶电泳分离和质谱鉴定，病毒粒子的结构蛋白有六种，分别为VP1（48 kDa）、VP2（50 kDa）、VP3（53 kDa）、VP4（55 kDa）、VP5（72 kDa）和VP6（97 kDa），其中VP1、VP2、VP3由病毒的基因组VD1-ORF3编码，推测VP1、VP2、VP3由核糖体以渗漏扫描机制翻译形成。VP4是一个家蚕的葡萄糖苷酶（Glucosidase-Bombyx mori），VP5可能是家蚕的储藏蛋白（Arylphorin．-Bombyx mori），VP6可能是一种DNA依赖型的RNA聚合酶（DNA-directed RNA polymerase）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 缩写与符号
• 第一章 绪论
• 1.1 家蚕浓核病毒的分类地位
• 1.1.1 细小病毒的特征
• 1.1.2 浓核病毒的特征
• 1.1.3 家蚕浓核病毒 I型的特征
• 1.1.4 家蚕浓核病毒 II型的特征
• 1.2 家蚕浓核病毒中国株的生物学特性
• 1.2.1 家蚕浓核病毒中国株的形态特征
• 1.2.2 家蚕浓核病毒中国株的理化性状和血清学特征
• 1.2.3 家蚕浓核病毒中国株的基因组结构
• 1.2.4 家蚕浓核病毒中国株与家蚕浓核病毒2型的主要差异
• 1.3 家蚕浓核病毒中国株的致病性和危害
• 1.3.1 病症特征和组织病变
• 1.3.2 家蚕对浓核病毒中国株的感受性
• 1.3.3 家蚕浓核病毒中国株在蚕业生产中的危害
• 1.3.4 家蚕浓核病的诊断
• 1.4 荧光定量 PCR技术
• 1.4.1 定量 PCR的理论依据
• 1.4.2 定量 PCR的分类
• 1.4.3 荧光定量 PCR主要原理及检测模式
• 1.4.4 荧光定量 PCR的应用
• 1.5 质谱技术
• 1.5.1 电喷雾电离质谱（ESI-MS）
• 1.5.2 基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）
• 1.5.3 快原子轰击质谱
• 1.5.4 质谱在生命科学中的应用
• 1.6 生物信息学工具
• 1.7 立题的目的意义
• 1.8 主要研究内容和技术路线
• 1.8.1 研究内容
• 1.8.2 技术路线
• 第二章 家蚕浓核病毒（中国株）在不同感受性宿主体内的复制
• 2.1 主要实验仪器设备
• 2.2 主要实验试剂和药品
• 2.3 材料
• 2.3.1 供试病毒
• 2.3.2 家蚕品种
• 2.4 样本制备
• 2.4.1 病毒接种液制备
• 2.4.2 病毒接种方法
• 2.4.3 取样方法
• 2.4.4 样本 DNA提取—采用酚氯仿法抽提
• 2.4.5 阳性对照样本（病毒接种液） DNA提取
• 2.5 标准样品制备（标准质粒）
• 2.5.1 靶标基因和参比基因
• 2.5.2 引物设计
• 2.5.3 构建靶标基因和参比基因的克隆
• 2.6 荧光定量 PCR检测
• 2.6.1 荧光定量 PCR反应体系
• 2.6.2 荧光定量 PCR反应条件
• 2.7 标准曲线的绘制
• 2.7.1 标准样品的定量和梯度稀释
• 2.7.2 生成标准曲线
• 2.8 数据分析方法
• 2.9 结果与分析
• 2.9.1 荧光定量 PCR结果的评估
• 2.9.2 定量的标准曲线
• 2.9.3 荧光定量结果分析
• 2.10 讨论与总结
• 第三章 家蚕浓核病毒中国镇江株的病毒结构蛋白初步分析
• 3.1 主要实验仪器设备
• 3.2 主要实验试剂和药品
• 3.3 家蚕浓核病毒 BMDNV-3的分离纯化
• 3.3.1 Bm DNV-3病毒接种液制备
• 3.3.2 添毒、取材
• 3.3.3 氯仿抽提
• 3.3.4 硫酸铵盐析
• 3.3.5 CsCl梯度离心
• 3.4 病毒蛋白SDS-PAGE电泳
• 3.4.1 蛋白提取
• 3.4.2 BmDNV-3病毒蛋白SDS-PAGE电泳
• 3.5 质谱分析
• 3.5.1 胶内消化
• 3.5.2 点样、质谱分析
• 3.6 结果与分析
• 3.6.1 PAGE凝胶电泳结果
• 3.6.2 肤指纹图谱（PMF）分析
• 3.6.3 部分多肽氨基酸序列分析（ De Novo Sequencing）
• 3.7 讨论与总结
• 第四章 总结与展望
• 4.1 主要工作总结
• 4.2 工作展望
• 参考文献
• 致谢
• 在学期间发表论文