论文摘要
黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1,AFB1）主要是由寄生曲霉（Aspergillus.parasiticus）和产毒黄曲霉（A.flavus）产生的有毒次生代谢产物,是目前发现的毒性最大的真菌毒素,广泛存在于各种食品和饲料中,严重威胁人类和动物的生命安全。为了降低AFB1对人类和动物的危害,世界各国不断制定尽可能低的食品和饲料中AFB1的限量标准,并通过检验检疫机构进行监测。目前AFB1的检测方法大多需要专门的仪器设备并且操作繁琐,已无法满足现场快速检测的要求。因此,建立一种方便、简易、快速的AFB1检测方法非常重要和必要。本研究以单克隆抗体和胶体金标记技术为基础,根据竞争抑制原理,建立了黄曲霉毒素B1的金标免疫斑点检测方法,主要研究结果如下:1抗AFB1单克隆抗体的制备与纯化采用体内培养法,将能够稳定分泌抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株3F8接种于BALB/c小鼠腹腔,106个/只,共接种5只,获得30 mL腹水抗体。通过亲和层析法纯化,5 mL亲和层析柱,每次可获得2.80 mg高纯度的抗AFB1单克隆抗体。采用ELISA法分析抗体免疫活性,结果表明,纯化前后抗体效价无明显变化,比效价有所提高。2胶体金及免疫金探针的制备采用柠檬酸三钠还原法,成功制备20 nm胶体金溶胶。此基础上建立了抗AFB1单克隆抗体的胶体金标记条件:最佳标记pH值为7.5,最佳标记量为15μg抗AFB1单克隆抗体/mL胶体金。采用ELISA方法分析了免疫金探针活性,结果表明,标记前后抗体效价无明显变化。3黄曲霉毒素B1金标免疫斑点检测方法的建立根据竞争抑制原理,以金标抗AFB1单克隆抗体作为分析探针,AFB1完全抗原AFB1-cBSA偶联物作为包被抗原,羊抗鼠IgG为质控点,初步建立了AFB1的金标免疫斑点检测体系（dot immunogold assay,DIGA）。当包被抗原浓度为10μg/mL,免疫金探针为原液时,肉眼判定AFB1检测限为10 ng/mL,检测时间为10 min左右。该方法对AFG1和AFG2特异性良好,与AFB2有较明显的交叉反应。4黄曲霉毒素B1的加标回收将5种不同浓度（2.5、5、10、20、40 ng/mL）的AFB1添加到不含AFB1的大米粉中,混匀,制备不同污染程度的样品。分析比较DIGA法和ELISA法对AFB1的回收情况。当添加的AFB1浓度低于10 ng/mL时,有红色斑点形成,高于10 ng/mL时,无红色斑点出现,同时以ELISA方法做平行实验,其回收率较高。