论文摘要
玉米（Zea mays L.）不仅是重要的粮食和饲料作物,也是重要的食品工业原料和能源植物。在我国,玉米产量仅次于水稻,在国民经济中占有非常重要的地位。干旱胁迫是自然界中主要的非生物胁迫之一,严重影响植物生长及作物生产。我国有60%的玉米种植面积受到干旱胁迫,每年因旱灾而减产20%～30%,直接影响国民经济发展及灾区人民生活。在玉米的生育期中,玉米苗期相对而言较为耐旱,适度的苗期干旱处理还可促进根系发育,增加玉米产量。而开花期前后受到干旱胁迫会严重影响玉米的产量。抽雄开花期是玉米对干旱最为敏感的时期之一,搞清楚在这一时期干旱对玉米的伤害及玉米对干旱的适应和调节机制,对于培育抗旱玉米品种具有重要意义,也是国内外学者关注的重要课题之一。本研究以抽雄开花期的玉米为材料,利用玉米全基因组芯片检测了叶片在玉米植株受到干旱胁迫1天和7天时的基因表达谱;利用抑制性消减杂交技术构建了1天和7天干旱胁迫下抽雄开花期玉米叶片的两个消减文库并对部分阳性克隆进行了测序分析。本研究还克隆了玉米基因ZmFtsH2A、ZmFtsH2B和Ⅱ型H+-PPase全长,并对它们进行了初步分析。主要实验结果如下:利用玉米全基因组芯片（microarray）检测了抽雄开花期玉米在1天和7天干旱胁迫下叶片中基因表达谱的变化情况。该芯片包含了57452个玉米寡核苷酸探针,代表了3万多个基因。以处理和对照样品的信号值的比值不低于2倍的探针为有意义的差异表达基因,发现在1天和7天两种干旱胁迫处理的玉米叶片中分别有195个和1008个基因呈现差异表达。在1天胁迫下的叶片中有102个基因表现上调,93个基因表现下调,上调的基因数占差异表达基因总数的52%;而在7天胁迫的叶片中有332个基因表现上调,676个基因表现下调,上调基因数只占33%。在两种处理下的叶片中则共有1144个基因呈现差异表达,其中有上调基因412个,下调基因732个,而在两种胁迫的叶片中均表现上调和均表现下调的基因分别只有22个和37个。通过对这些差异表达基因的生物信息学分析,发现在干旱胁迫1天表达显著上调的基因中,约有1/3属于信号传导类基因,参与细胞不同信号转导途径,表明信号传导相关基因在玉米对干旱胁迫的早期反应中起重要作用。在7天干旱胁迫下,大量的代谢相关基因差异表达,特别是渗透保护因子代谢相关基因的表达变化,如脯氨酸合成途径中的P5CS和P5CR基因表达上调而其降解途径的关键酶基因ProDH表达下调,海藻糖合成途径中的TPS和TPP表达下调而其降解途径的酶基因Trehalase表达上调,而参与棉子糖合成代谢的多个重要酶基因均受胁迫诱导上调表达。该工作表明,干旱对抽雄开花期玉米叶片基因表达的影响是复杂的,涉及到多条代谢途径,较长时间的干旱处理引起大量代谢相关基因差异表达,并且以下调表达为主;脯氨酸积累和糖代谢变化在玉米叶片对干旱胁迫的应答中起重要作用。本实验所得芯片杂交数据已提交至NCBI的GEO数据库（Gene Expression Omnibus database）,获得的注册号为:GSE10596。分别以1天干旱和7天干旱处理的抽雄开花期玉米叶片cDNA为tester,正常生长的玉米叶片cDNA为driver,使用抑制性消减杂交技术构建了两个干旱胁迫下玉米叶片的消减文库。两个文库的重组率均高于95%,插入片段集中在300—600bp之间。对两个文库部分克隆进行测序发现,文库中含有脱水素、蔗糖合成酶、甜菜碱醛脱氢酶、DRE结合因子等大量的抗旱相关基因,说明两个干旱胁迫下抽雄开花期玉米抑制性消减文库已经构建成功,且具有重要意义。在抽雄开花期玉米叶片消减文库阳性克隆测序结果中,得到一条长为192bp的EST,使用同源性分析软件BLASTN检索NCBI的GenBank数据库发现该EST是玉米FtsH蛋白酶基因的部分cDNA序列。以该EST序列为种子探针,检索玉米EST数据库,将得到的匹配序列进行拼接,得到两条contig（重叠群）序列,分别长为2510bp和2430bp,两条序列在核苷酸水平上的相似性为95%,均含有2034bp的完整的开放读码框（open reading frame,ORF）,是玉米的AtFtsH2-like（类拟南芥FtsH2）基因,被分别命名为ZmFtsH2A和ZmFtsH2B。根据电子克隆结果,分别在ZmFtsH2A和ZmFtsH2B的ORF两侧设计基因特异性引物,以玉米cDNA为模板,PCR扩增得到含有ORF的cDNA片段,测序结果证实了电子克隆的正确性。将ZmFtsH2A和ZmFtsH2B的cDNA序列提交至GeneBank数据库,获得的登录号为EU257690与EU257691。ZmFtsH2A的cDNA序列长2510bp,包含217bp的5′非翻译区（UTR）和241bp长的3′非翻译区（UTR）以及一个2034bp的开放读码框（ORF）;与其相类似,ZmFtsH2B的cDNA序列长2430bp,包含222bp的5’UTR和56bp长的3’UTR及2034bp长的ORF。两个基因均编码677个氨基酸,其蛋白序列相似性高达97%且均存在AAA结构域和Zn2+结合结构域等已知的金属蛋白酶FtsH家族的特征结构域。这两个基因的全长基因组序列分别长为4420bp（ZmFtsH2A）和5187bp（ZmFtsH2B）,均由5个外显子和4个内含子组成,所有内含子的边界都具有真核生物典型的内含子切除位点GT/AG序列,编码区所在的外显子部分长度完全一样,而两个基因最大的区别在于ZmFtsH2B的第1内含子（1785bp）远长于ZmFtsH2A的第1内含子（913bp）。Southern杂交结果表明两个基因在玉米基因组中均是单拷贝的。表达谱分析表明两个基因在玉米的根、茎、叶、和雌雄穗中都有表达,但ZmFtsH2B在各组织中的表达量均明显高于ZmFtsH2A。在PEG、盐、冷、ABA和MeJA处理下,ZmFtsH2A基因在玉米根和叶片组织中的表达变化水平均没有达到2倍,而ZmFtsH2B基因仅在玉米叶片中受渗透胁迫和外源ABA的诱导上调表达,在其它情况下呈现组成型表达。为了分析ZmFtsH2A、ZmFtsH2B基因的生理功能,通过转基因技术分别获得了分别转ZmFtsH2A和ZmFtsH2B基因的烟草植株,并对转基因植株进行了耐旱性分析。初步结果表明:两个AtFtsH2-like基因在烟草中表达并没有提高烟草植株的耐旱性。本论文还构建了18%PEG处理下苗期玉米叶片的消减文库,对部分文库进行测序分析时得到了玉米Ⅱ型H+-PPase基因的长为764bp的EST序列。以该EST为探针,检索玉米的EST数据库,经几轮电子延伸后得到仅是该基因3′端序列的1511bp长的contig。接下来从水稻的核酸数据库中找出这条contig在水稻中的同源基因,并以该基因的5′端序列为探针,再次检索玉米的EST数据库,将匹配的玉米ESTs进行拼接后得到另一条长为898bp的contig,该contig含有该基因的5′端序列信息。这样,我们电子克隆出玉米Ⅱ型H+-PPase基因的两端序列（中间序列未知）,并依此设计基因特异性引物通过RT-PCR技术获得了该基因完整ORF的cDNA片段,并进一步利用3′RACE方法克隆了该基因的3′非翻译区序列。玉米Ⅱ型H+-PPase基因全长2974bp,包含一个长2400bp的通读框,编码含779个氨基酸残基的蛋白质序列。该氨基酸序列同样具有H+-PPase蛋白的5个保守结构域,与拟南芥的Ⅱ型H+-PPase（AVP2）在氨基酸水平上具有89%的序列相似性,而与玉米Ⅰ型H+-PPase相似性却只有39%。Southern杂交结果表明Ⅱ型H+-PPase在玉米基因组中是低拷贝的。表达谱分析表明该基因在根、茎、叶、和雌雄穗中都有表达,其中在叶片和雄穗中表达强度比较高。Real-time PCR实验结果表明该基因的转录水平受缺水、高盐和冷胁迫等非生物胁迫诱导上调,显示该基因可能参与植物对多种非生物胁迫的耐受反应,克隆的玉米Ⅱ型H+-PPase基因可能有较好的应用前景。