体外诱导脂肪来源干细胞向成骨细胞分化的相关研究

论文摘要

骨缺损的修复一直是矫形外科的难题。利用自体骨、异体骨、异种骨、带血管游离植骨进行修复都存在这样或那样的问题。上世纪80年代开始,骨缺损的修复进入了组织工程修复研究的时代。支架材料、生长因子、种子细胞是组织工程的三要素,随着制造技术的进步,支架材料的研究已取得突飞猛进的进展,已有人工骨应用于临床。种子细胞是组织工程骨构建和应用研究中的重要环节和基本要素,同时也是保证骨组织工程学持续性深入研究的前提,如何获取数量充足、功能良好的种子细胞是目前制约组织工程发展的瓶颈之一。骨髓基质干细胞（bone marrow stem cells, BMSCs）作为骨组织工程种子细胞已经广泛应用[1],但是在临床研究中发现自骨髓取材获取细胞数量有限,不能满足需要,且大量抽取骨髓会增加机体创伤,有一定的并发症[2]。脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。研究发现ADSCs细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低,同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞,适宜大规模培养,对机体损伤小等优点,而且其来源广泛,体内储备量大,适宜自体移植,逐渐成为近年来新的研究热点之一。构建组织工程骨通常首先要对种子细胞向成骨细胞进行矿化诱导,使其成为具有活性的组织工程细胞,因此,探索ADSCs的最佳矿化条件,使其在最短的时间内成为具有活性的成骨细胞是一个非常有实际意义的课题。本研究通过在不同诱导条件下使ADSCs向成骨细胞分化,初步摸索其最佳矿化条件,为骨组织工程提供种子细胞。1 rhBMP-2诱导脂肪来源干细胞向成骨细胞分化的量效作用探讨体外条件下rhBMP-2诱导脂肪来源干细胞向成骨细胞分化和增殖的情况,并观察其量效关系。从成年兔颈后部获取脂肪组织,采用酶消化法分离并培养脂肪来源干细胞;稳定传代后,用不同浓度rhBMP-2对ADSCs进行诱导分化,采用碱性磷酸酶染色及I型胶原免疫组化染色进行成骨细胞鉴定,采用碱性磷酸酶活性测定及MTT方法进行分化和增殖活性比较。结果发现,rhBMP-2诱导ADSCs后碱性磷酸酶及I型胶原免疫组织化学染色为阳性;当rhBMP-2在100-400ng/ml时,各组碱性磷酸酶活性提高明显（P<0.05）,在400ng/ml以上各组则无明显差别（P>0.05）;当rhBMP-2在800ng/ml以下时,各组增殖活性无明显差别（P>0.05）,在800ng/ml以上则存在明显的抑制作用,各组存在明显差别（P<0.05）。研究表明,在体外条件下rhBMP-2能诱导脂肪来源干细胞向成骨细胞分化;并且rhBMP-2浓度在400-800ng/ml时,能促进脂肪来源干细胞的增殖和分化。2脂肪来源干细胞向成骨细胞分化的优化研究探讨脂肪来源干细胞在不同矿化诱导条件下的生物学特性,优化最佳矿化条件。从成年兔颈后部分离并培养出脂肪来源干细胞,稳定传代后,采用普通矿化液诱导组、BMP诱导组、矿化液-BMP联合诱导组体外诱导兔脂肪成体干细胞,以含10℅小牛血清的DMEM作为对照组,采用碱性磷酸酶染色及I型胶原免疫组化染色进行成骨细胞鉴定,采用碱性磷酸酶活性测定及MTT方法进行分化和增殖活性比较。结果发现,实验组碱性磷酸酶及I型胶原免疫组织化学染色为阳性,对照组则为阴性;与对照组相比,实验组脂肪来源干细胞的增殖均有所抑制,而碱性磷酸酶活性增加,其中矿化液-BMP联合诱导组产生的成骨细胞表型最为显著。研究表明,在体外条件下联合应用矿化液和BMP能在较短时间内有效诱导ADSCs分化为成骨细胞,促进脂肪来源干细胞的分化。3年龄对脂肪来源干细胞向成骨细胞分化的影响观测年龄因素对脂肪来源干细胞体外向成骨细胞分化能力的影响。对不同年龄（3周、5月、2年）来源的兔脂肪来源干细胞进行分离培养,观察细胞形态,稳定传代后,采用地赛米松对ADSCs进行成骨诱导分化,通过碱性磷酸酶染色、钙结节染色和I型胶原免疫组织化学染色观察分化情况,通过检测碱性磷酸酶活性和MTT法比较其成骨能力和分化后的增殖活性。实验结果显示,成骨诱导后碱性磷酸酶染色、钙结节染色和I型胶原免疫组织化学染色均为阳性,碱性磷酸酶活性及MTT活性检测显示各组之间不存在明显差别,表明不同年龄来源的脂肪来源干细胞在体外的诱导成骨能力无明显差别。4结论①本研究成功从兔脂肪组织中分离出脂肪来源干细胞进行体外培养,并能够在体外稳定增殖传代,在地赛米松和rhBMP-2的诱导下均能够成功的向成骨细胞分化。②rhBMP-2诱导ADSCs的成骨分化存在一定的量效关系,当rhBMP-2在100-400ng/ml时,各组碱性磷酸酶活性提高明显,在400ng/ml以上各组则无明显差别;当rhBMP-2在800ng/ml以下时,各组增殖活性无明显差别,在800ng/ml以上则存在明显的抑制作用。因此,rhBMP-2浓度在400-800ng/ml时,能促进脂肪来源干细胞的增殖和分化。③在体外条件下联合应用矿化液和BMP能在较短的时间内有效诱导ADSCs分化为成骨细胞,能够促进脂肪来源干细胞的分化。④不同年龄来源的脂肪来源干细胞在体外的诱导成骨能力无明显差别。关键词4结论①本研究成功从兔脂肪组织中分离出脂肪来源干细胞进行体外培养,并能够在体外稳定增殖传代,在地赛米松和rhBMP-2的诱导下均能够成功的向成骨细胞分化。②rhBMP-2诱导ADSCs的成骨分化存在一定的量效关系,当rhBMP-2在100-400ng/ml时,各组碱性磷酸酶活性提高明显,在400ng/ml以上各组则无明显差别;当rhBMP-2在800ng/ml以下时,各组增殖活性无明显差别,在800ng/ml以上则存在明显的抑制作用。因此,rhBMP-2浓度在400-800ng/ml时,能促进脂肪来源干细胞的增殖和分化。③在体外条件下联合应用矿化液和BMP能在较短的时间内有效诱导ADSCs分化为成骨细胞,能够促进脂肪来源干细胞的分化。④不同年龄来源的脂肪来源干细胞在体外的诱导成骨能力无明显差别。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言和文献回顾
• 正文
• 实验一 rhBMP-2 诱导脂肪成体干细胞向成骨细胞分化的量效作用
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 实验二 脂肪来源干细胞矿化诱导条件的优化研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 实验三 不同年龄来源ADSCs向成骨细胞诱导效果的比较
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢