绵羊肺炎支原体标准株Y98P30和P40基因的克隆及P30免疫原性研究

论文摘要

绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae,MO）是一种严重危害绵羊的常见致病菌。近年来,随着养羊业的不断发展,绵羊支原体肺炎也随之大范围的出现,给养羊业造成了巨大的经济损失。本研究通过Hayflick氏液体培养基对绵羊肺炎支原体标准株Y-98进行菌种复壮,用绵羊肺炎支原体Y98全蛋白制备抗原免疫新西兰兔制备高免血清,利用间接ELISA及Western blot初步确定绵羊肺炎支原体Y98主要外膜抗原蛋白。结果表明,绵羊肺炎支原体Y98的主要抗原蛋白可能是外膜蛋白中66,40,36和30KD。根据猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp）的P30和P46基因序列为模板设计引物,克隆获得MO的P30和P40基因,采用重叠延伸PCR将TGA定点突变为TGG。结果表明,扩增获得的MO的P30基因与Mhp的P30基因同源性达79%；MO的P40基因与Mhp的一个未知功能的基因同源性达到74%。通过软件分析了MO的P30基因与Mhp的P30基因抗原表位及跨膜结构。结果表明：MO-P30与Mhp-P30的抗原表位高度一致,相似性可达97.5%,且MO-P30和Mhp-P30跨膜结构完全一致,均属于跨膜蛋白。1-37氨基酸是膜内区域,38-60是跨膜区域,61-最后一个氨基酸是膜外区域。综上所述,MO-P30可能是绵羊肺炎支原体主要抗原蛋白之一。成功构建P30和P40基因的原核表达质粒,分别命名为pET-TB30和pET-TB40,转化受体菌Rossta,得到重组菌株Rossta （pET-TB30）和Rossta （pET-TB40）, IPTG诱导后进行SDS-PAGE及western blot,结果表明pET-TB30诱导后可见分子量为30KD左右的目的条带,主要以包涵体形式存。pET-TB40没有出现特异条带。对基因工程菌株Rossta （pET-TB30）进行动物保护性实验。结果表明,注射量为75ug和100ug抗原蛋白的免疫血清中,均有大小为30KD的特异性阳性带。动物免疫试验中组织切片结果表明,未免疫的有感染症状小鼠的肺部实体区的肺泡形成大面积的融合性病灶,病灶周围肺泡壁增厚,肺泡肿胀,肺泡结构退化消失,血管结构破坏出现渗血现象。肝细胞排列不整齐,肝细胞实体变空,胞浆内有明显的颗粒状物质。肾脏有轻微肿大,可能肾组织毛细血管有轻度出血,颜色红褐色。部分肾小管的上皮细胞颗粒变性,腔隙变大；部分免疫保护的小鼠肺组织、肝脏组织和肾脏组织切片未见异常。综上所述,Rossta （pET-TB30）原核表达的外源蛋白对小鼠有一定的保护作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 引言
• 1. 文献综述
• 1.1 支原体概况
• 1.2 绵羊肺炎支原体的分类地位和生物学性质
• 1.2.1 分类地位
• 1.2.2 形态与结构
• 1.3 流行病学调查
• 1.4 绵羊肺炎支原体的感染及有关症状
• 1.4.1 临床诊断
• 1.4.2 组织病变
• 1.5 绵羊肺炎支原体致病机制的研究进展
• 1.6 绵羊肺炎支原体诊断、防治措施及存在问题
• 1.6.1 诊断技术
• 1.6.2 防治措施
• 1.6.3 存在问题
• 2 绵羊肺炎支原体标准株Y98主要外膜抗原蛋白的确定
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 绵羊肺炎支原体标准株Y-98复壮结果
• 2.2.2 绵羊肺炎支原体Y98全蛋白与膜蛋白的结果分析
• 2.2.3 间接ELISA结果
• 2.2.4 Western blot结果
• 2.3 小结
• 3 绵羊肺炎支原体Y98 P30和P40基因的克隆及定点突变实验
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 绵羊肺炎支原体Y98外膜蛋白P30基因和P40基因的PCR扩增结果
• 3.2.2 P30基因和P40基因质粒鉴定结果
• 3.2.3 P30基因和P40基因的测序及序列比对
• 3.2.4 P30基因抗原表位的分析
• 3.2.5 P30基因跨膜结构的预测
• 3.2.6 P30基因和P40基因的定点突变
• 3.2.7 P30基因和P40基因酶切鉴定结果
• 3.2.8 P30基因和P40基因重叠延伸PCR测序结果
• 3.3 小结
• 4. 绵羊肺炎支原体Y98的P30和P40基因原核表达质粒构建及免疫原性研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 P30和P40基因重组质粒酶切鉴定结果
• 4.2.2 外源蛋白SDS-PAGE分析
• 4.2.3 表达产物在大肠杆菌细胞中的分布
• 4.2.4 Western blot检测表达产物结果
• 4.2.5 测定小鼠攻毒剂量（MLD）的结果
• 4.2.6 疫苗安全性检验结果
• 4.2.7 ELISA检测小鼠抗体效价结果
• 4.2.8 Western blot
• 4.3 小结
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 后记（含致谢）
• 攻读学位期间取得的科研成果清单