转雪花莲凝集素基因小麦抗蚜性及建立高效小麦转化体系的研究

论文题目: 转雪花莲凝集素基因小麦抗蚜性及建立高效小麦转化体系的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 作物遗传育种

作者: 梁辉

导师: 孙东发,贾旭

关键词: 小麦,基因枪转化,雪花莲凝集素,蚜虫,抗性,电激转化,环形电极,幼胚

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 小麦是中国和世界上最重要的粮食作物之一，但其生产正受到虫害日益严重的威胁。应用基因工程手段培育抗虫品种已成为解决小麦虫害的一种有效途径。豫麦66是高产、优质、抗病小麦新品种，但该品种易感蚜虫，限制了其产量潜力的进一步发挥。植物凝集素是一类具有特异糖结合活性的蛋白，存在于许多植物的种子和营养器官中。基于植物凝集素和糖的特异相互识别的特性，一般认为植物凝集素不仅在植物体内具有一定的功能，如作为氮源、特异的识别因子等，更重要的是它还可能作为防御蛋白发挥作用。已经发现多种植物凝集素具有抵抗农业害虫的特性，特别是对蚜虫等同翅目害虫具有抗杀作用。此外，植物凝集素还可以抵抗植物病原性线虫、真菌及病毒的侵染。雪花莲凝集素是植物凝集素的一种，它属于单子叶甘露糖结合凝集素家族，对具有刺吸式口器的同翅目害虫具有毒杀作用。本研究用基因枪法将雪花莲凝集素基因（GNA14）转入普通春小麦品种中-60634和生产上正在推广的冬小麦高产品种——豫麦66中，分别获得了抗蚜性良好的转基因抗蚜小麦新材料。但实验中发现，基因枪转化法不仅转化频率偏低（平均1％左右），而且使用费用偏高，限制了大规模基因工程分子育种工作的开展。故应用一种适用于普通24孔培养板的便携式、可重复使用的环形电极，将外源基因转入完整的小麦幼胚组织并获得稳定遗传的转基因植株，建立了一种环形电极电激法介导的简便、快速、高效、经济的高频率小麦基因转化系统。 1．应用基因枪转化法将雪花莲凝集素基因（GNA14）转入普通春小麦品种中-60634和生产上正在推广的冬小麦高产品种——豫麦66中，分别获得了转基因小麦植株。对转基因小麦当代及其后代进行PCR及Southern杂交检测，证明外源基因已稳定整合到小麦基因组中。中-60634和豫麦66的外源基因转化频率均为0.37％。 2．抗蚜实验证明，转化gna基因的小麦植株对我国北方冬麦区的主要麦蚜——麦长管蚜和禾谷缢管蚜的抗性效果不尽相同。对禾谷缢管蚜，在接种当代即表现出明显的毒杀作用。对麦长管蚜，则表现为虫体发育减缓并且降低了其所生产的若蚜成活率。在自然放养条件下，gna基因则对这两种麦蚜的取食均起到了一定的抑制作用。 3．获得20个豫麦66抗蚜新材料分别来自由8个独立的转基因T0代抗蚜植株所获得的73个T1代转基因单株。T0代转基因植株与对照相比对蚜虫的抗性表现出极为显著的差异，特别是禾谷缢管蚜在生态盒中的死亡率高达47.1％～71.7％，比对照（16.0％）提高31.1％～55.7％。T1代植株开放接蚜鉴定，3w后观察发现，转基因植株未找到任何蚜虫，推测可能迁移至对照植株上。2个中-60634抗蚜新材料表现为减缓蚜虫虫体发育并且降低若蚜成活率。

论文目录:

摘要

ABSTRACT

缩略语

第一章 前言

1.1 文献综述

1.1.1 小麦转基因技术研究进展

1.1.2 植物凝集素的分子生物学研究进展

1.1.3 植物凝集素在抗虫植物基因工程中应用的进展

1.1.4 电激法直接转化完整植物细胞技术的研究进展

1.2 研究目的和意义

第二章 雪花莲凝集素基因转化小麦及转基因小麦抗蚜性的研究

2.1 材料和方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 转gna基因小麦的获得

2.2.2 转gna基因小麦的抗蚜性分析

2.2.3 快速检测转基因植株后代中外源基因(bar)的整合

2.3 讨论

2.3.1 雪花莲凝集素(gna)基因在转基因抗虫应用研究中的适合性

2.3.2 雪花莲凝集素(gna)基因对麦蚜的抗性作用

2.3.3 转基因植株后代分离群体中快速鉴定转基因植株

2.3.4 植物基因工程与常规育种的关系

第三章 环形电极介导的小麦基因转化

3.1 材料和方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.2 结果与分析

3.2.1 电激的物理参数及渗透剂的选择

3.2.2 外源基因在小麦基因组中的整合

3.2.3 外源基因(bar)在小麦基因组中整合拷贝数的检测

3.2.4 电激法获得的转基因当代植株(T_0)表型分析

3.2.5 环形电极电激法介导的小麦外源基因转化频率

3.3 讨论

3.3.1 质壁分离影响电激法转化小麦完整植物组织的转基因频率

3.3.2 电激参数影响电激法转化小麦完整植物组织的转基因频率

3.3.3 外源基因在植物基因组中整合的拷贝数

3.3.4 转基因植株的表型变异

3.3.5 环形电极电激法介导的高频率小麦基因转化

结语与展望

参考文献

在学期间发表的论文

致谢

附录

附录Ⅰ 用于转化的质粒DNA结构

附录Ⅱ 植物培养基成分

附录Ⅲ 质粒DNA的提取

发布时间: 2006-12-12

参考文献

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