海洋环己酮降解菌及环己酮降解基因的研究

论文摘要

“21世纪是手性化学发展的世纪”, 2001年诺贝尔化学奖就授予分子手性催化的主要贡献者。很多药物及生物活性物质是具有手性特征的,手性制药是目前医药行业的前沿领域和高速增长的领域,是各大制药企业竞争的热点之一,手性技术也是21世纪势必快速发展的领域。不仅仅是医药领域,食品,化工,微电子,材料,等众多领域都会因为手性技术的发展得到巨大改变。而目前所有手性催化剂中,将酮催化为具有手性的酯的最佳催化剂是在不动杆菌中发现的环己酮单加氧酶。本文从太平洋深海获得了一株可利用环己酮为唯一碳源进行生长的微球菌CN1,该菌不仅表现出除转化环己酮外的诸多性能。如不具有致病性,生长速度快,而且可耐受高浓度环己酮（>44%）,并且在16%（V/V）的环己酮中生长最好。CN1可在12m M的重铬酸钾中生长,可利用高浓度氰化钾（250mM）,还能产生植物生长素——吲哚乙酸。而CN1表现的最重要的功能是,它可以高转化率,高手性率的将极为廉价的非手性药物中间体双环[3,2,0] -2-双键-6-酮加氧转化为极为昂贵的手性酯,生成物与反应物的市场价格相差近1000倍。不同于已有报道,环戊酮却不能被CN1转化,表明CN1中的环己酮加氧酶有着较为特别的底物利用范围。环己酮可被CN1降解,环己醇可转化为环己酮后降解,环己醇又阻碍自身通过环己酮途径降解。环己酮在氧气不充足或环己酮较多的情况下,转化为环己醇。通过分析环己酮降解的中间代谢产物发现,环己酮有多种途径进行代谢,不仅可通过β-氧化途径降解,通过转化为环己醇后合成其他物质,还有可能直接水解。通过Southern杂交,结合基因组文库构建,获得了环己酮降解的完整基因簇。整个基因簇与具有高GC含量的红球菌,节杆菌的基因簇比较接近,而与目前研究的较深入的不动杆菌的基因簇无论从单个基因还是基因排布还是调控基因的类型上都差别很大。通过反转录结合PCR发现CN1的这个基因簇与阿拉伯糖操纵子有很高的相似性,其两个启动子紧挨着位于基因簇中部,并在环己酮诱导的情况下向相反的方向转录。利用GC-MS验证环己醇脱氢酶和环己酮加氧酶的转化功能,并且还发现在环己醇脱氢酶与环己酮加氧酶共表达的条件下,前者的活性远远高于后者。在大肠杆菌中异源表达了CN1的环己酮单加氧酶,发现大都形成了包涵体,通过稀释复性从而获得了有活性的酶。通过构建了CN1环己酮单加氧酶及所有BVMO家族蛋白的三维结构模型,结合系统发育分析,发现BVMO家族蛋白中心相当保守,发现并推测一条保守的多肽对于酶的性质影响很大,不认同一些学者对BVMO催化中心的见解,提出了BVMO蛋白有额外的底物结合区,和新的催化机理模型。此外,通过组合碳源,富集培养基,筛选培养基等要素,从印度洋热液口的一个泥样中分离到30个属的116株细菌,其中16株菌的16SRNA序列与网上比对的最高相似度低于或等于97%。通过GC-MS检测发现其中有19株可转化环己酮,随机选9株菌进行southern杂交验证,发现这些菌中确实含有环己酮加氧酶。与已报道的筛菌方法相比不仅开创了新的环己酮降解菌的高效筛选方法,而且在一个泥样中获得的环己酮降解菌的数目为全世界已发表的环己酮降解菌的总和的两倍。另外还研究了包括CN1的20株菌的降解范围和降解效率。通过扩增烷烃羟化酶alkB和细胞色素氧化酶P450,发现这两个基因与环己烷的降解存在正相关性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 21 世纪将是手性技术和手性药物发展的世纪
• 1.2 手性技术的发展情况
• 1.3 Baeyer-Villiger 反应
• 1.4 环己酮单加氧酶（CHMO）
• 1.5 CHMO 催化机理
• 1.6 环己酮的代谢途径相关基因及CHMO 在其过程中的作用
• 1.7 环己酮利用菌的CHMO 基因及部分其他BVMO 基因的克隆
• 1.8 TYPE 1 型BVMO 的比较及底物范围的差异
• 1.9 环己酮加氧酶结构与功能的研究
• 1.10 利用环己酮单加氧酶的催化工艺改进
• 1.11 利用环己酮单加氧酶进行天然手性物质合成或生物制药的应用---
• 1.12 本论文的研究目的及意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 基本操作
• 2.3 方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 环己酮降解菌CN1 的筛选及功能研究
• 3.1.1 环己酮降解菌的筛选
• 3.1.2 pH，盐度，温度及环己酮浓度对CN1 生长的影响
• 3.1.3 抗生素抗性范围
• 3.1.4 CN1基因组GC含量测定
• 3.1.5 CN1的碳源利用范围
• 3.1.6 CN1对环己醇，环己酮，环戊酮的生物转化
• 3.1.7 厌氧情况下，CN1 对环己酮的降解
• 3.1.8 CN1 对药物中间体双环[3,2,0] -2-双键-6-酮的手性转化
• 3.1.9 CN1 环己酮的诱导表达分析
• 3.1.10 CN1 环己酮单加氧酶基因的克隆
• 3.1.11 环己酮降解过程中中间产物的研究
• 3.1.12 对环己酮代谢途径的推测
• 3.1.13 CN1 上表现的其他功能
• 3.2 环己酮单加氧酶基因及基因簇的克隆和功能研究
• 3.2.1 CN1 基因组酶切及杂交
• 3.2.2 含CHNB 的4.6k 的片段的克隆及鉴定
• 3.2.3 4.6K 核酸片段上的基因排布及特点
• 3.2.4 ChnB，ChnE，密码子使用的特点
• 3.2.5 ChnA，ChnB 的功能验证
• 3.2.6 CN1 基因组文库的构建
• 3.2.7 CN1 基因文库的筛选与鉴定
• 3.2.8 16C-9，16F-10 质粒的测序及整个环己酮降解基因簇的拼接
• 3.2.9 对所获基因簇的开放编码阅读框的分析
• 3.2.10 对所获基因簇上非编码区的分析
• 3.2.11 CN1 环己酮加氧酶系统发育分析
• 3.2.12 对CN1 环己酮加氧酶同源建模分析
• 3.2.13 CHNB 蛋白模型中氨基酸位置总体特征
• 3.2.14 九种环己酮加氧酶核心区域的建模分析
• 3.2.15 对一条重要多肽的分析
• 3.2.16 BVMO 反应机理的推测
• 3.2.17 ChnB 及其缺失突变在大肠杆菌中的表达
• 3.2.18 ChnB 与其他融合标签的共表达
• 3.2.19 His –ChnB 包涵体的复性
• 3.2.20 讨论
• 3.3 利用5 种碳源对印度洋热液口泥样的菌群富集和单菌分离
• 3.3.1 菌群分析
• 3.3.2 在属的水平上对筛选的手段及结果的分析
• 3.3.3 在富集筛选的过程中从表观发现的几株比较有特点的菌
• 3.3.4 用GC-MS 检测55 株菌对环己酮，环己醇，环戊酮，苯乙酮的转化
• 3.3.5 利用GC-MS 对其余61 株菌环己酮降解菌进行筛选
• 3.3.6 通过southern 杂交验证环己酮降解菌中环己酮加氧酶基因的存在
• 3.3.7 利用GC-MS 对19 株菌进行降解性能和降解范围的测定
• 3.3.8 相同165 的菌在GC-MS 分析的差异
• 3.3.9 部分菌alkB，p450 基因的克隆
• 3.3.10 讨论
• 参考文献
• 致谢