海藻糖合酶基因转化佛手（Citrus medica L.var.sarcodactylis）方法的研究

论文摘要

佛手,学名Citrus medica L. var. sarcodactylis,为芸香科柑桔属香椽的变种。它不仅是是闻香赏果的花卉珍品,又是传统的名贵中药。我国佛手的主要栽培地区有广东、福建、四川、浙江等,其中浙江金华所产的佛手品质最为优良,为佛手中的上品。但其冬季不抗寒,造成冬季大部分佛手受冻死亡,严重影响佛手的品质和产量。随着现代生物技术的迅猛发展,基因工程为解决这一问题提供了有效的方法和途径。　本试验同时研究了农杆菌介导和基因枪两种遗传转化方法,分别探讨了两种转化方法的影响因素,优化了转化条件,初步建立了佛手农杆菌遗传转化系统,确定了影响基因枪转化效率的几个重要参数利用PCR 技术检测到外源基因（TPS）的导入,利用GUS 报告基因检测到外源基因在抗性愈伤组织中的表达。为遗传转化提供了分子生物学依据。主要结果如下:　1 以佛手叶片为外植体,筛选出适宜佛手再生的基本培养基为MT,以MT 为基本培养基,诱导愈伤组织配方:附加激素为2,4-D 1.5mg·L-1,NAA 1.0 mg·L-1,6-BA 0.4 mg·L-1,诱导频率达98.1%,分化培养基:附加激素6-BA 5mg·L-1 和IAA 0.5 mg·L-1。2 通过对叶片预培养时间、侵染时间、共培养时间、抑菌素种类和浓度、延时筛选时间、不同选择压等遗传转化影响因素的研究,建立的佛手遗传转化体系为:叶片黑暗预培养3 天,菌液浓度OD600 为0.6-0.8 的农杆菌中浸染20 分钟,在附加物为L-cys 400 mg·L-1、AS 100μmol·L-1 诱导愈伤组织培养基上黑暗共培养3 天,然后转移至附加物为250 mg·L-1 Cef、250 mg·L-1 Cb、400 mg·L-1 L-cys、AS 100μmol·L-1 黑暗培养2-4 天,再进行Km 100 mg·L-1 的选择压黑暗培养至抗性愈伤组织出现,转为光照条件下1-2 次的继代筛选,获得抗性芽后,进行扩繁。　3 取幼嫩叶片,用直径为1.0μm 金弹轰击叶片,在轰击距离为6cm,轰击压力为1100psi,真空度26 inches Hg,恢复培养时间为48 小时左右时。GUS 瞬时表达效率最高达17.8%,表达活性也最高。轰击次数对GUS 瞬时表达效率影响不明显。　4 以根癌农杆菌LBA4404 介导TPS 基因转化佛手叶片,获得抗性愈伤组织。对其

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 第一章 综述
• 1.1 佛手概况
• 1.1.1 佛手的品种及其特征
• 1.1.2 资源分布
• 1.1.3 真伪鉴别
• 1.1.4 观赏价值
• 1.1.5 药用价值
• 1.1.6 化学成分
• 1.2 植物遗传转化概述
• 1.3 果树遗传转化
• 1.4 主要基因转化方法
• 1.4.1 农杆菌（Agrobacterium）介导的基因转化方法
• 1.4.1.1 根癌农杆菌
• 1.4.1.2 根癌农杆菌Ti质粒
• 1.4.1.3 根癌农杆菌介导的基因转移机制
• 1.4.1.4 根癌农杆菌介导方法的优缺点
• 1.4.2 基因枪法
• 1.4.2.1 理化因素
• 1.4.2.2 生物因素
• 1.4.2.3 基因枪法进行遗传转化的优缺点
• 1.4.3 农杆菌介导法与基因枪法相结合的转化方法
• 1.5 海藻糖及海藻糖合酶基因简介
• 1.5.1 海藻糖的生物学功能
• 1.5.2 海藻糖的应用前景
• 1.5.3 海藻糖合酶基因遗传转化的研究进展
• 引言
• 第二章 实验材料与实验方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 实验菌株
• 2.2 试剂及主要仪器
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 PCR 引物
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 常用的溶液
• 2.2.4.1 常用缓冲液及试剂的成分与配制
• 2.2.4.2 抗生素储备液
• 2.2.4.3 提取质粒DNA 所用试剂
• 2.2.4.4 提取植物DNA 所用试剂
• 2.2.5 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 佛手高效再生系统的建立
• 2.3.2 转化受体选择压力的确定
• 2.3.3 农杆菌介导转化法
• 2.3.3.1 菌种的保存
• 2.3.3.2 菌种的活化和预处理
• 2.3.3.3 预培养时间对遗传转化效率的影响
• 2.3.3.4 佛手叶片与农杆菌共培养
• 2.3.3.5 侵染时间和浓度对遗传转化效率的影响
• 2.3.3.6 共培养时间对遗传转化效率的影响
• 2.3.3.7 乙酰丁香酮（ AS）的添加对佛手转化效率的影响
• 2.3.3.8 除菌培养时间对遗传转化的影响
• 2.3.3.9 抑菌抗生素对叶片转化的影响
• 2.3.3.10 转化体的筛选及植株再生
• 2.3.4 基因枪法的遗传转化
• 2.3.4.1 质粒的大量提取和纯化
• 2.3.4.2 质粒DNA 的纯化
• 2.3.4.3 质粒的浓度及纯度检测
• 2.3.4.4 材料准备
• 2.3.4.5 基因枪轰击操作
• 2.3.4.6 试验采取的处理组合
• 2.3.4.7 真空度对转化效率的影响
• 2.3.4.8 轰击后恢复培养时间对转化效率的影响
• 2.3.4.9 转化体的筛选
• 2.3.5 GUS 活性的组织化学检测
• 2.3.6 植株的PCR 检测
• 第三章 结果与分析
• 3.1 再生体系的建立
• 3.1.1 培养基类型对愈伤组织诱导的影响
• 3.1.2 生长素类对愈伤组织诱导的影响
• 3.1.3 植物激素组合对佛手愈伤组织诱导的效应
• 3.2 遗传转化体系的建立
• 3.2.1 卡那霉素敏感性实验
• 3.2.2 不同浓度卡那霉素（Km）对佛手愈伤组织分化的影响
• 3.2.3 预培养时间对遗传转化的影响
• 3.2.4 农杆菌感染时间和浓度对遗传转化的影响
• 3.2.5 菌液浓度对GUS 瞬时表达率的影响
• 3.2.6 不同抗生素的抑菌效果比较
• 3.2.7 羧苄青霉素和头孢霉素浓度的确定
• 3.2.8 共培养对遗传转化的影响
• 3.2.9 半胱氨酸的添加对佛手转化的影响
• 3.2.10 乙酰丁香酮（ AS）的添加对佛手转化效率的影响
• 3.2.11 除菌培养时间对遗传转化的影响
• 3.3 基因枪转化条件初探
• 3.3.1 质粒的鉴定
• 3.3.2 氦气压力对GUS 瞬时表达的影响.
• 3.3.3 真空度对GUS 瞬时表达的影响
• 3.3.4 射程对GUS 瞬时表达的影响
• 3.3.5 GUS 瞬时表达检测时间的确定
• 3.3.6 轰击次数对GUS 瞬间表达的影响
• 3.3.7 抗性愈伤的分子生物学鉴定
• 第四章 讨论
• 4.1 激素对佛手叶片愈伤组织诱导和分化的影响
• 4.2 愈伤组织增殖培养过程中应该注意的问题
• 4.3 转基因方法的确定
• 4.4 标记基因及选择剂的影响
• 4.5 影响农杆菌方法遗传转化的主要因素
• 4.5.1 农杆菌浓度对转化效率的影响
• 4.5.2 外植体的影响
• 4.5.3 预培养时间的影响
• 4.5.4 共培养的影响
• 4.5.5 液体除菌对遗传转化的影响
• 4.5.6 乙酰丁香酮（As）对遗传转化的影响
• 4.6 基因枪转化系统的优化
• 4.7 转化体的筛选及鉴定
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介