论文摘要
背景：自噬是细胞通过自噬囊泡的形成和溶酶体的参与下对胞质内长寿命蛋白或者受损细胞器（如：内质网、高尔基体和线粒体）降解的过程，实现一些氨基酸和蛋白质的回收和利用。细胞生长过程存在一定的基础水平的自噬，作为细胞内的清理系统来维持细胞的稳态。在多种应激的条件下（如：饥饿、氧应激或者细胞毒性以及病原体感染），会激活自噬。在多种的生理或者生理病理过程中，会出现自噬的下调，如衰老、肿瘤和神经退行性变疾病。在肿瘤形成过程，自噬具有抑制肿瘤形成和促进肿瘤形成的双向的作用，主要取决于细胞背景的不同。自噬的双向作用现象同样存在于放疗和化疗过程中。有报道，因自噬支持癌细胞在不利的条件下的生存而产生抵抗治疗的作用。在其他情况下，诱导自噬会导致肿瘤细胞死亡（也被称为II型程序性细胞死亡），从而增强肿瘤放、化疗的治疗效果。因此，对自噬分子机更多的了解和适合体外应用的自噬调控因素的发现将显著的有益于临床肿瘤的治疗。最近，一个重要基因（Ataxia telangiectasia mutated，ATM）发现对自噬具有调控作用。ATM是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于PIKK（phosphoinositide3-kinase-related protein kinase family，PIKK）蛋白激酶家族成员。在电离辐射引起的DNA损伤的情况下，ATM通过一系列的调控会诱导细胞周期阻滞、凋亡和DNA修复等，维持基因组的稳定。最近，ATM被发现在细胞毒性或者活性氧应激的情况下，上调自噬进程。ATM通过激活AMPK/LKB1/TSC2信号通路，抑制自噬网络中的关键基因mTORC1（mammalian target ofrapamycine complex1）的表达而激活自噬。因此，通过化学或者基因技术调控ATM来调控自噬进程成为肿瘤研究的热点。MicroRNA（miRNA）是一类短的单链非编码的RNA分子（2022核苷酸）。miRNA是DNA转录形成发夹环状结构的前体pre-miRNA（60–110核苷酸），从细胞核转运到细胞质中经过过剪切成为成熟的miRNA。miRNA通过与靶基因mRNA的3’UTR（3’-untranslated region）结合抑制基因的转录后翻译而抑制基因的表达。据预测，哺乳动物中有60%的编码基因受到miRNA的调控。汇总当前miRNA的研究成果，miNRAs几乎对所有的细胞进程具有调控作用，如分化、生长、凋亡等。MiRNA表达谱的改变与人类疾病，尤其肿瘤密切相关。MiRNAs通过与自噬相关基因（autophagy-regulating genes，Atgs）的调控也参与自噬进程的调控。MiR-30a和miR-376b被证明通过抑制靶基因Beclin-1的激活而抑制自噬。MiR-101通过抑制在自噬体形成早期阶段发挥作用的基因RAB5A抑制自噬。目的：尽管，microRNA-自噬相互作用的研究领域还处在初始阶段，但是这一领域的研究，帮助我们对自噬有更深层分子调控机制的理解和提供将来应用治疗的前景。本研究目的寻找有效调控ATM的miRNA，并进一步的研究其对基础水平和电离辐射诱导的自噬的影响。方法：（1）通过生物信息学预测工具预测以ATM为靶基因的miRNAs；（2）PCR调取含有预测的miR-18a结合位点的部分ATM基因3’UTR序列，构建在荧光素酶载体；（3）双荧光素酶报告基因分析验证miR-18a与靶基因3’UTR的结合；（4）深部X射线治疗机进进行细胞放射治疗；（5）Western blot检测基因蛋白水平的变化；（6）应用qRT-PCR的方法检测细胞内miRNA的表达情况；（7）应用GFP-LC3定位分析和MAP1LC3的Western blot监测自噬进程；（8）集落形成实验验证细胞的电离辐射敏感性；（9）Cellcounting Kit-8（CCK8）试剂盒分析细胞增殖活性；（10）应用Student’s t-test或χ2检验统计分析，p<0.05表示差异有统计学意义；（11）Image J软件分析蛋白电泳条带值。结果：1. MiR-18a与ATM3’UTR有潜在的结合根据三个生物信息学预测工具（Miranda, Targetscan, andmiRDB），ATM是miR-18a的靶基因。人类和其他哺乳类动物（包括黑猩猩、恒河猴、小鼠、大鼠、狗和兔）的ATM3’UTR序列均存在非常保守的miR-18a结合靶点（人类ATM3’-UTR上的3481-3488位置）。2. MiR-18a结合并上调ATM基因的表达经双荧光素酶报告基因分析，惊奇的发现在结肠癌HCT116细胞中，miR-18a上调ATM3’-UTR荧光素酶载体表达活性。与ATM3’-UTR荧光素酶载体共转染的miR-18amimic和NC组的荧光素酶值分别为90%和30%（**P<0.01）。应用慢病毒载体PCDH-vector构建的miR-18a表达载体验证也获得了相似的结果（*P<0.05）。经蛋白电泳检测，电离辐射（4Gy）增加HCT116细胞ATM蛋白的表达（1.6倍）。与转染NC（Negative control）比，转染miR-18a mimic后HCT116细胞ATM蛋白的表达升高1.6倍。而抑制miR-18a表达后，同时联合或者不联合电离辐射，HCT116细胞中ATM的表达都减低近50%。3.电离辐射上调细胞内miR-18a的表达qRT-PCR检测，电离辐射1h后，内源性miR-18a的表达升高超过200倍。电离辐射后7h，miR-18a的表达水平比假照组高出5倍。表明miR-18a的表达随着电离辐射作用后时间变化而变化。上述结果表明，miR-18a可能在电离辐射诱导的细胞反应中（例如自噬）发挥一定作用。4.过表达miR-18a促进HCT116细胞的自噬构建稳定表达的HCT116GFP-LC3细胞模型，分析miR-18a对HCT116细胞自噬的影响。HCT116GFP-LC3细胞转染NC组自噬阳性的细胞8%，过表达miR-18a的mimics组自噬升高，自噬阳性的细胞达15%（**P <0.01）。蛋白电泳检测LC3-II的变化，与对照组比较，电离辐射使LC3-II升高3.5倍，转染miR-18a mimic组LC3-II的表达升高2倍。P62/SQSTM1多聚泛素结合蛋白，与ATG8/LC3结合并定位在自噬体，最终被降解。P62/SQSTM1蛋白的表达水平反应自噬的量。在过表达miR-18a组和过表达miR-18a联合照射组，P62/SQSTM1的表达水平比转染NC组减低近50%。这些结果表明，miR-18a在HCT116细胞中增加自噬通量（autophagicflux）。5.过表达miR-18a抑制mTORC1活性据报道ATM通过抑制mTORC1的表达上调自噬。我们推测miR-18a上调ATM的表达，应该抑制mTORC1进而激活自噬。通过蛋白电泳检测mTORC1下游一个典型的反映其活性的蛋白，P70S6K的Thr389位点磷酸化情况。结果，转染miR-18a mimic或者转染mimic联合照射后，P70S6K蛋白的Thr389位点磷酸化都明显的受到抑制。6过表达miR-18a增加HCT116细胞的电离辐射敏感性集落形成分析表明，与转染NC各组比较，转染miR-18a mimic后4Gy、6Gy和8Gy明显的降低细胞存活分数（分别为*P<0.05，*P<0.05和**P<0.01）。7过表达miR-18a后抑制结肠癌细胞的增殖。CCK-8分析表明，与转染NC组比较，过表达miR-18a后显著抑制了HCT116和SW116细胞的增殖，细胞增殖活性降低到近70%（**P<0.01）。而抑制miR-18a则促进HCT116细胞株的增殖（**P<0.01）。结论：1ATM基因是miR-18a新的靶基因，但在HCT116细胞中过表达miR-18a升高ATM基因的表达（在电离辐射前和电离辐射后）。这样现象可能是miR-18a对ATM基因3’UTR结合、调控所致，且依赖于不同的细胞背景。2HCT116细胞中过表达miR-18a可以直接激活基础水平的自噬和增强电离辐射诱导的自噬，致少是部分通过上调自噬调控基因ATM发挥的作用。过表达miR-18a后，通过检测P70S6K蛋白Thr389位点磷酸化受到抑制的情况表明，miR-18a抑制mTORC1的活性，支持miR-18a上调ATM的结论。3过表达miR-18a增加HCT116细胞对电离辐射的敏感性。4在结肠癌中miR-18a是发挥抑癌作用的miRNA。综上所述，本研究揭示miR-18a新的重要的靶基因ATM和miR-18a新的功能，在细胞关键性事件自噬中发挥作用。miR-18a对ATM和自噬的调控作用在肿瘤的发生、发展、治疗以及其他的疾病中会发挥重要作用。因此，miR-18a是结肠癌表观遗传学治疗很好的靶点。