论文摘要
研究目的:反复短暂的缺血/再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）使心肌对随后长时间I/R损伤耐受性增强的一种现象,即为缺血预适应（ischemic preconditioning,IP）。与IP类似,反复短暂的大强度运动使心肌对随后的损伤耐受性增强的现象,即为运动预适应（ exercise preconditioning,EP）。EP诱导强大的心肌保护效应已得到证实,但其机制尚未完全阐明。因此,本研究以IP为研究背景,以EP对力竭运动所致心肌损伤的保护效应为研究基础,紧紧围绕触发物质—中介物质—效应物质的细胞信号转导模式,以中介物质蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）为研究核心,探讨心肌δPKC亚型和效应物质热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）在EP早期和晚期保护时相中的变化规律及相互关系,为EP心肌保护效应及其机制的研究提供更新的理论和实验依据。研究方法:250只健康雄性SD大鼠随机分为10组:C组,对照组。EE组,进行一次大强度力竭跑台运动,以此复制大鼠急性心肌损伤模型。EEP组,以一次大强度间歇跑台运动建立EP模型,以EP后0.5 h为早期保护效应观察时间点。CHE+EEP组,EP前腹腔注射PKC抑制剂白屈菜红碱（chelerythrine,CHE）,余同EEP组。EEP+EE组,EP后0.5 h运动至力竭。CHE+EEP+EE组,EP前腹腔注射CHE,余同EEP+EE组。LEP组,进行一次EP,以EP后24 h为晚期保护效应观察时间点。CHE+LEP组,EP前腹腔注射CHE,余同LEP组。LEP+EE组,EP后24 h运动至力竭。CHE+LEP+EE组,EP前腹腔注射CHE,余同LEP+EE组。应用免疫化学发光法检测血清心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I,cTnI）含量,酶联免疫吸附法检测血清氨基末端前体脑钠肽（N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP）含量,在血清心肌损伤标志物检测的基础上,应用苏木素碱性复红苦味酸（haematoxylin basie fuchsin picric,HBFP）染色观察心肌组织缺血缺氧改变,透射电镜技术观察心肌细胞超微结构变化,综合评价心肌结构和功能的变化,探讨EP在早期和晚期保护时相对力竭运动大鼠心肌的保护作用及PKC抑制剂CHE对保护作用的影响。应用免疫组织化学技术（SABC法）显示大鼠心肌δPKC、p-δPKCThr507和HSP70蛋白的分布,免疫印迹法检测心肌δPKC、p-δPKCThr507和HSP70蛋白表达水平,实时荧光定量PCR法检测心肌δPKC mRNA和HSP70 mRNA表达水平,原位杂交技术观察心肌δPKC mRNA的分布,揭示EP早期、晚期保护时相和力竭运动后δPKC、p-δPKCThr507和HSP70蛋白,δPKC和HSP70基因分布和表达的规律,并探讨EP心肌保护效应中PKC抑制剂CHE对δPKC和HSP70蛋白及基因表达的影响。研究结果:（1）与C组比较,EE组大鼠血清心肌损伤标志物cTnI和NT-proBNP浓度显著上升,心肌缺血缺氧严重,超微结构改变明显。与EE组相比,EEP+EE组大鼠血清cTnI和NT-proBNP浓度明显下降,心肌缺血缺氧和超微结构改变减轻;LEP+EE组大鼠力竭运动能力明显提高,力竭运动后血清cTnI浓度显著降低,NT-proBNP浓度则无明显改变,心肌缺血缺氧改变加重,超微结构损伤严重。与EEP+EE组相比,CHE+EEP+EE组大鼠血清cTnI水平,心肌缺血缺氧情况和超微结构无明显改变,但NT-proBNP水平显著降低。与LEP+EE组相比,CHE+LEP+EE组大鼠血清cTnI水平无明显变化,但NT-proBNP水平显著降低,心肌缺血缺氧改变和超微结构损伤明显减轻。（2）与C组比较,EE组大鼠心肌δPKC和其磷酸化形式p-δPKCThr507蛋白表达水平明显升高,δPKC在胞质中颗粒状匀质分布,p-δPKCThr507以细胞中点状散在分布为主;HSP70蛋白表达水平无明显变化,在胞质中弥散匀质分布;HSP70 mRNA表达水平明显升高,但δPKC mRNA的表达水平和分布无明显改变。（3）与C组比较,EEP组大鼠心肌δPKC和其磷酸化形式p-δPKCThr507蛋白表达水平明显升高,δPKC在胞质中仍呈颗粒状匀质分布,但p-δPKCThr507由安静下的胞质点状散在分布转为闰盘和细胞核的明显表达;HSP70蛋白表达水平无明显变化,在胞质中弥散匀质分布;δPKC mRNA和HSP70 mRNA的表达水平,δPKC mRNA的分布无明显变化。与EE组相比,EEP+EE组大鼠心肌δPKC和p-δPKCThr507蛋白表达水平均明显降低,但p-δPKCThr507仍持续表达于在闰盘和细胞核上,δPKC mRNA表达水平和分布无明显变化;HSP70蛋白表达水平无明显变化,HSP70蛋白在心肌中的免疫阳性区域明显减少,HSP70 mRNA表达水平明显下降。（4）与C组比较,LEP组大鼠心肌δPKC蛋白表达水平仍显著升高,p-δPKCThr507蛋白水平无明显变化,但仍可见其分布于闰盘上;δPKC mRNA表达水平明显升高,在胞质中的原位杂交信号显著增强;HSP70蛋白表达水平仍显著升高,HSP70 mRNA表达水平无明显变化。与EE组相比,LEP+EE组大鼠心肌δPKC蛋白表达水平无明显变化,p-δPKCThr507蛋白表达水平明显降低,δPKC的分布形式未有变化,但p-δPKCThr507仅在胞质中散在点状分布,免疫阳性区域明显减少,δPKC mRNA表达水平和分布无明显变化;HSP70蛋白表达水平无明显变化,HSP70蛋白在心肌组织中的免疫阳性区域明显减少,HSP70 mRNA表达水平明显下降。（5）CHE对大鼠心肌δPKC mRNA的表达水平和分布没有明显的影响,但提高其蛋白表达水平。其中,与EEP+EE组相比,CHE+EEP+EE组大鼠心肌δPKC蛋白表达水平明显升高;与LEP组相比,CHE+LEP组δPKC蛋白表达水平明显升高;与LEP+EE组相比,CHE+LEP+EE组δPKC和p-δPKCThr507蛋白表达水平均明显升高。注射CHE后大鼠心肌HSP70蛋白表达表达水平有下降趋势,HSP70的分布形式无明显变化。但与LEP组相比,CHE+LEP组HSP70蛋白表达表达水平明显升高。与EEP组相比,CHE+EEP组HSP70 mRNA表达水平明显下降;与LEP+EE组相比,CHE+LEP+EE组HSP70 mRNA表达水平明显下降。研究结论:（1）大强度力竭跑台运动造成大鼠一定程度的心肌损伤。EP在早期保护时相具有明显的心肌保护效应。EP在晚期保护时相明显提高大鼠的力竭运动能力,但未能对力竭运动所致心肌损伤起到明显的保护作用。PKC抑制剂CHE未影响EP早期时相的保护效应,但减轻EP晚期保护时相力竭运动所致心肌损伤。（2）EP抑制δPKC的过度表达,并促使p-δPKCThr507向闰盘和细胞核等处转位是EP早期心肌保护效应中细胞信号转导机制的关键环节。CHE对δPKC mRNA的表达水平和分布没有明显的影响,但可提高其蛋白的表达水平,以EP晚期保护时相尤为明显,其生物学机制尚需进一步研究。（3）EP早期保护时相HSP70的表达无明显变化是EP使心肌产生良好适应的结果,EP早期保护时相力竭运动后HSP70 mRNA水平显著下降,提示EP能提高心肌对应激的适应能力,从而减轻心肌损伤的程度。CHE影响HSP70的表达,以其基因的表达水平为明显,EP晚期保护时相δPKC和HSP70的表达均明显升高,提示PKC与HSP70的调控存在一定关系。（4）EP晚期保护时相δPKC和HSP70表达增加,提示两者参与了EP晚期心肌保护效应。