BCG编码的miRNA鉴定及其功能研究

论文摘要

[目的]微小RNA（microRNA,miRNA）是一类对基因进行转录后水平调控的小分子非编码RNA。近年来,在植物、哺乳动物、果蝇、线虫以及病毒中都发现有大量的miRNA存在且广泛的参与各种生理和病理过程,但是在原核生物中是否也包含miRNA尚未见报道。本研究利用分子生物学技术,生物信息学探索结核杆菌中是否存在miRNA,并确定其在结核杆菌的生长过程中所发挥的作用,进而对原核生物中miRNA的加工机制做了初步探讨。[方法]首先用超声法提取结核杆菌的总RNA,然后将小RNA分离,通过Solexa测序,得到克隆出的小RNA序列信息。随后运用生物信息学软件Mireap对得到的小RNA用软件进行二级结构的预测,观测其是否有特定的二级结构前体。利用Northern Blot方法验证在结核杆菌中是否存在预测到的序列。通过Real-time PCR技术检测这些miRNAs的内源性表达水平。利用电转化的方法将内源性miRNAs封闭或过表达其前体的表达水平,观察其在结核杆菌增殖过程中所发挥的调控作用。最后利用荧光报告系统确定其靶基因。[结果]Solexa测序结果显示,在BCG中存在388种已知miRNA同源序列和42种新的miRNA。Real-time PCR显示了这些miRNA在BCG中内源性表达水平。利用生物信息学技术预测了这些小RNA二级结构和碱基偏爱性。通过电转化将BCG-miR-07和BCG-miR-21的反义寡核苷酸序列（ASO）转入BCG中,证实其对BCG的生长起到抑制作用。最后验证了 BCG-miR-07直接靶定ICD2和ABC transporter 基因。[结论]本实验首次证实了结核杆菌中存在miRNA,并通过实验证明BCG-miR-07和BCG-miR-21对结核杆菌的生长有抑制作用。同时这也是首次在原核生物中发现miRNA。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、结核杆菌（BCG）中非编码小RNA的克隆鉴定及生物信息学分析
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 主要试剂及配制
• 1.1.2 主要仪器与设备
• 1.1.3 实验方法与步骤
• 1.2 结果
• 1.2.1 BCG中非编码小RNA的克隆（Solexa测序）
• 1.2.2 BCG中存在已知的miRNAs同源序列
• 1.2.3 BCG中新的miRNAs的预测
• 1.2.4 BCG中miRNAs的鉴定
• 1.2.5 BCG中内源性miRNAs的表达水平
• 1.2.6 BCG中miRNAs的生物信息学分析
• 1.2.7 BCG中miRNAs的碱基偏爱性不同于已知的真核miRNA
• 1.3 小结
• 二、结核杆菌（BCG）中非编码小RNA的功能研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 主要试剂及配制
• 2.1.2 主要仪器与设备
• 2.1.3 实验方法与步骤
• 2.2 结果
• 2.2.1 BCG-miR-07和BCG-miR-21抑制BCG的生长
• 0097c）和ABC transporter（BCG₀231）的CDS区'>2.2.2 BCG-miR-07直接靶定ICD2（BCG₀097c）和ABC transporter（BCG₀231）的CDS区
• 2.2.3 BCG中miRNA与靶基因互补配对于"种子"序列
• 2.2.4 原核中类似miRNA的加工系统
• 2.3 小结
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 癌症的表观基因组学
• 综述参考文献
• 致谢