家蝇幼虫抗病毒蛋白的分离纯化及其生物活性研究

论文摘要

本文以家蝇幼虫为研究对象,在实验室前期研究基础上,采用色谱分离方法和分析鉴定技术从家蝇幼虫体内分离纯化获得了抗病毒活性蛋白（HAP）,测定了其抗病毒活性、清除自由基和淋巴细胞增殖活性,并对其分子构象表征进行了初步解析,同时还研究了中间产物家蝇幼虫清蛋白的抗生物氧化、免疫药理活性以及副产物几丁糖的抗氧化、抗真菌、抗肿瘤活性,为家蝇幼虫的深层次综合开发利用提供了实验基础,主要研究结果如下:1.家蝇幼虫清蛋白的抗病毒和抗氧化活性研究在实验室前期研究的基础上,测定了家蝇幼虫清蛋白对两种昆虫病毒（AcMNPV和BmNPV）的抗病毒活性。实验结果表明,家蝇幼虫清蛋白对AcMNPV具有良好的抗病毒活性,并能显著降低家蚕病毒BmNPV对家蚕的侵染能力。非脂质体系抗氧化、体外、体内抗生物氧化等实验结果表明家蝇幼虫清蛋白还能有效清除自由基和减弱肝组织匀浆及肝线粒体脂质过氧化反应,抑制机体红细胞氧化溶血,保护细胞膜结构和功能的完整,避免细胞受损伤,并能显著地降低老龄小鼠肝匀浆和血清中的脂质过氧化产物MDA的含量,对机体内超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力也具有显著的增强作用,显示出良好的抗氧化性能和延缓衰老的作用。2.家蝇幼虫清蛋白的免疫药理活性研究从非特异性免疫、细胞免疫与体液免疫三个方面进行了动物体内实验,家蝇幼虫清蛋白能刺激正常小鼠免疫器官的增长,增强正常小鼠的巨噬细胞非特异性吞噬能力和血清溶血素活性,能促进脾脏和胸腺中Con A活化和未活化的T淋巴细胞、脾脏中LPS活化的B淋巴细胞增殖,并能显著增强脾NK细胞对肿瘤细胞YAC-1的杀伤作用。实验结果表明家蝇幼虫清蛋白具有良好的免疫调节功能。3.家蝇幼虫抗病毒蛋白的分离纯化及其理化特性研究采用离子交换色谱DEAE-52、凝胶过滤色谱Sephadex G-100和Sephadex G-75柱层析,从家蝇幼虫清蛋白中分离获得了一种对昆虫病毒AcMNPV和BmNPV具有良好抗病毒活性的蛋白级分HAP。紫外扫描分光光度分析、层析法、电泳法和反相高效液相色谱鉴定其为具有色谱纯和电泳纯的样品。HAP还具有良好的羟基自由基和超氧阴离子自由基清除活性,并能在体外细胞水平上显著促进小鼠淋巴细胞的增殖,显示了较强的体外抗氧化活性和免疫调节功能。4.家蝇幼虫抗病毒蛋白的分子构象分析采用紫外光谱、红外光谱、荧光光谱和圆二色谱等分析技术研究了HAP在溶液中的分子构象。实验结果显示,HAP具有典型的蛋白质紫外吸收光谱图,在280nm波长附近有最大吸收峰;二级结构主要以β-折叠和无规卷曲结构为主,α-螺旋结构含量较少,β-折叠结构含量为79.1%,无规卷曲结构含量为17.3%,α-螺旋结构含量为3.6%;HAP最大发射波长在332nm处,最佳激发波长为283nm。5.副产物几丁糖的生物活性研究将已提纯过清蛋白的家蝇幼虫残渣进一步分离获得了活性物质几丁糖,并对其生理活性功能和理化特性进行了分析研究,实验结果表明家蝇幼虫几丁糖具有良好的还原力、金属离子鏊合能力以及清除自由基活性,其作用效果与阳性对照抗坏血酸和EDTA相似。家蝇幼虫几丁糖对七种植物病原真菌（棉花立枯病、弯孢霉、花生白绢病、水稻纹枯病、油菜菌核病、番茄叶霉病和匍枝根霉）均具有抗菌活性,其中对匍枝根霉的作用效果最佳,半数抑制浓度IC50为0.20mg/mL。此外,在体外细胞水平上家蝇幼虫几丁糖对两种肿瘤细胞（Hela细胞和S-180细胞）的增殖也具有良好的抑制作用,均呈现剂量效应关系。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 昆虫体内生物活性物质的研究现状
• 1.1 昆虫抗菌肽
• 1.1.1 昆虫抗菌肽的类型
• 1.1.1.1 天蚕素类抗菌肽族
• 1.1.1.2 昆虫防御素
• 1.1.1.3 富含脯氨酸的抗菌肽族
• 1.1.1.4 富含甘氨酸的抗菌肽族
• 1.1.2 昆虫抗菌肽的应用
• 1.2 昆虫抗病毒蛋白/多肽
• 1.2.1 病毒简介及其危害
• 1.2.2 抗病毒蛋白的研究现状
• 1.2.3 昆虫抗病毒蛋白/多肽的研究现状
• 1.3 昆虫凝集素
• 1.4 昆虫溶菌酶和多酚氧化酶
• 1.5 昆虫金属硫蛋白
• 1.6 昆虫抗冻蛋白
• 1.7 昆虫几丁糖
• 1.8 昆虫体内其他活性物质的应用
• 2 蛋白质分离纯化常用技术手段
• 2.1 离子交换色谱
• 2.2 凝胶过滤色谱
• 2.3 亲和色谱
• 2.4 共价色谱
• 3 家蝇的利用研究现状
• 4 本课题的选题思想及研究的目的和意义
• 第二章 家蝇幼虫清蛋白的抗病毒和抗氧化活性研究
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 试虫及其饲养方法
• 2.1.2 病毒来源
• 2.1.3 细胞和实验动物
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 脱脂蝇蛆粉的制备
• 2.2.2 家蝇幼虫清蛋白的分离提取工艺
• 2.2.3 家蝇幼虫清蛋白的抗病毒活性测定
• 2.2.3.1 对sf9细胞生长的影响
• 2.2.3.2 抗AcMNFV活性测定
• 2.2.3.3 抗家蚕病毒BmNPV感染试验
• 2.2.4 家蝇幼虫清蛋白的抗氧化活性测定
• 2.2.4.1DPPH自由基清除活性测定
• 2O₂诱导的红细胞氧化溶血的影响'>2.2.4.2 对H₂O₂诱导的红细胞氧化溶血的影响
• 2.2.4.3 对大鼠肝匀浆脂质过氧化的影响
• 2.2.4.4 对小鼠肝线粒体脂质过氧化的影响
• 2.2.4.5 对老龄小鼠脂质过氧化水平和抗氧化酶活性的影响
• 2.2.5 数据统计
• 3 结果与分析
• 3.1 家蝇幼虫清蛋白（PEF）的抗病毒活性测定
• 3.1.1 对sf9细胞生长的影响
• 3.1.2 抗AcMNPV活性测定
• 3.1.3 抗AcMNPV的活性观察
• 3.1.4 对BmNPV感染家蚕的抑制作用
• 3.1.5 抗BmNPV感染家蚕试验的活性观察
• 3.2 家蝇幼虫清蛋白的抗氧化活性测定
• 3.2.1 DPPH自由基清除活性测定
• 2O₂诱导的红细胞氧化溶血的影响'>3.2.2 对H₂O₂诱导的红细胞氧化溶血的影响
• 3.2.3 对大鼠肝匀浆脂质过氧化的影响
• 3.2.4 对小鼠肝线粒体脂质过氧化的影响
• 3.2.5 对老龄小鼠脂质过氧化水平和抗氧化酶活性的影响
• 4 讨论
• 第三章 家蝇幼虫清蛋白的免疫药理活性研究
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试样品
• 2.1.2 细胞和实验动物
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 对小鼠体重及免疫器官的影响
• 2.2.2 对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响
• 2.2.3 对小鼠迟发型超敏反应的影响
• 2.2.4 对半数溶血值的影响
• 2.2.5 对T、B淋巴细胞增殖的影响
• 2.2.6 对NK细胞杀伤活性的影响
• 2.2.7 对IL-2活性的影响
• 2.2.8 急性毒性试验
• 2.2.9 数据统计
• 3 结果与分析
• 3.1 对小鼠体重及免疫器官的影响
• 3.2 对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响
• 3.3 对小鼠迟发型超敏反应的影响
• 3.4 对半数溶血值的影响
• 3.5 对T、B淋巴细胞增殖的影响
• 3.6 对NK细胞杀伤活性的影响
• 3.7 对IL-2活性的影响
• 3.8 小鼠的急性毒性试验
• 4 讨论
• 第四章 家蝇幼虫抗病毒蛋白的分离纯化研究
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验试剂
• 2.3 实验设备和仪器
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 离子交换色谱DEAE-52柱层析
• 2.4.1.1 DEAE-52柱层析材料溶胀
• 2.4.1.2 漂洗
• 2.4.1.3 活化
• 2.4.1.4 装柱
• 2.4.1.5 柱平衡
• 2.4.1.6 样品预处理
• 2.4.1.7 上样与洗脱
• 2.4.1.8 样品浓缩
• 2.4.1.9 抗AcMNPV活性测定
• 2.4.2 凝胶过滤色谱Sephadex G-100柱层析
• 2.4.2.1 Seplmdex G-100柱材料的预处理
• 2.4.2.2 样品制备收集
• 2.4.2.3 上样及洗脱
• 2.4.2.4 样品收集与浓缩
• 2.4.2.5 各分离级分的抗病毒活性测定
• 2.4.3 凝胶过滤色谱Sephadex G-75柱层析
• 2.4.3.1 Sephadex G-75柱材料的处理
• 2.4.3.2 样品制备收集
• 2.4.3.3 上样及洗脱
• 2.4.3.4 样品收集与浓缩
• 2.4.3.5 各分离组分抗病毒活性测定
• 2.4.4 SDS-PAGE电泳分析
• 3 结果与分析
• 3.1 家蝇幼虫清蛋白的DEAE-52柱层析分离
• 3.1.1 DEAE-52分离纯化图谱
• 3.1.2 抗病毒活性测定
• 2的Sephadex G-100柱层析分离'>3.2 级分A₂的Sephadex G-100柱层析分离
• 3.2.1 Sephadex G-100分离纯化图谱
• 3.2.2 抗病毒活性测定
• 3.2.2.1 抗AcMNPV活性测定
• 3.2.2.2 抗家蚕核型多角体病毒BmNPV感染试验
• 2的Sephadex G-75柱层析'>3.3 级分B₂的Sephadex G-75柱层析
• 3.3.1 Sephadex G-75分离纯化图谱
• 3.3.2 抗病毒活性测定
• 3.3.2.1 抗AcMNPV活性测定
• 3.3.2.2 抗家蚕核型多角体病毒（BmNPV）的活性测定
• 3.3.3 SDS-PAGE电泳分析
• 4 讨论
• 第五章 家蝇幼虫抗病毒蛋白的纯度鉴定、分子构象及其生物活性研究
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验试剂
• 2.3 实验设备和仪器
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 凝胶过滤色谱鉴定抗病毒蛋白的纯度
• 2.4.2 RP-FIPLC分析
• 2.4.3 紫外光谱分析
• 2.4.4 傅立叶变换红外光谱分析
• 2.4.5 圆二色谱（CD）分析
• 2.4.6 荧光光谱分析
• 2.4.7 清除羟基自由基活性测定
• 2.4.8 清除超氧阴离子自由基活性测定
• 2.4.9 对淋巴细胞增殖活性的影响
• 3 结果与分析
• 3.1 凝胶过滤色谱鉴定蛋白的纯度
• 3.2 RP-HPLC分析
• 3.3 紫外光谱分析
• 3.4 傅立叶变换红外光谱分析
• 3.5 圆二色谱分析
• 3.6 荧光光谱分析
• 3.7 羟基自由基清除活性测定
• 3.8 超氧阴离子自由基清除活性测定
• 3.9 淋巴细胞增殖活性测定
• 4 讨论
• 第六章 副产物几丁糖的制备及其生物活性研究
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 虫源
• 2.1.3 细胞和真菌
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 副产物几丁糖的制备工艺
• 2.2.2 红外光谱分析
• 2.2.3 家蝇幼虫几丁糖的抗肿瘤活性测定
• 2.2.4 家蝇幼虫几丁糖的抗氧化活性测定
• 2.2.4.1 DPPH自由基清除活性测定
• 2.2.4.2 还原力测定
• 2.2.4.3 金属离子鏊合能力测定
• 2.2.4.4 羟基自由基活性测定
• 2.2.4.5 超氧阴离子自由基活性测定
• 2.2.5 家蝇幼虫几丁糖的抗真菌活性测定
• 3 结果与分析
• 3.1 家蝇幼虫几丁糖的红外光谱分析
• 3.2 家蝇幼虫几丁糖的抗肿瘤活性测定
• 3.3 家蝇幼虫几丁糖的抗氧化活性测定
• 3.3.1 DPPH自由基清除活性测定
• 3.3.2 羟基自由基活性测定
• 3.3.3 超氧阴离子自由基活性测定
• 3.3.4 还原力测定
• 3.3.5 金属离子鏊合能力测定
• 3.4 家蝇幼虫几丁糖的抗真菌活性测定
• 3.5 家蝇幼虫几丁糖的抗真菌活性观察
• 4 讨论
• 4.1 家蝇幼虫几丁糖的抗肿瘤活性
• 4.2 家蝇幼虫几丁糖的抗氧化活性
• 4.3 家蝇幼虫几丁糖的抗真菌活性
• 第七章 全文总结与展望
• 1 全文总结
• 2 本研究的创新点
• 3 研究展望
• 参考文献
• 附录 攻读博士学位期间发表论文
• 致谢