猪FcRn在黏膜上皮中的表达与分布研究

2020-12-13阅读(919)

论文摘要

黏膜是许多病原菌入侵机体的重要门户。一些组织器官可以通过它们的黏膜上皮来转运母源IgG,以使胎儿或新生儿获得被动免疫,而这个胞转过程,需要新生儿Fc受体（FcRn）的参与。研究表明,FcRn具有独特的重要功能,它不仅可以通过肠上皮、乳腺、胎盘和卵黄囊转运母源IgG,维持血液中IgG和白蛋白水平的相对稳定,还与动物的免疫应答密切相关。对FcRn的研究可以揭示机体转运IgG的机制,从而为兽医临床应用提供理论指导。本研究通过分子生物学方法克隆表达了猪FcRn的胞浆尾区（FcRn-CT）,并利用制备的兔抗猪FcRn-CT多克隆抗体,采用Western blot及免疫组织化学方法研究了FcRn在猪黏膜上皮中的表达及分布情况,从而为今后进一步开展猪黏膜上皮中表达的FcRn功能研究及应用提供理论依据。本研究取得的主要结果如下：1.猪FcRn基因的克隆根据GenBank上公布的猪FcRn基因序列设计引物,提取猪肝脏总RNA,利用RT-PCR方法扩增获得FcRn片段,回收后连接到pMD18-T载体上,对所得到的重组质粒pT-FcRn进行PCR、酶切鉴定及序列测定,与GenBank中登录号为AY740682的猪FcRn基因同源性为99%,进一步分析序列,结果显示FcRn的序列与AY740682的序列相比缺失81个碱基,即缺失27个氨基酸。2.猪FcRn-CT的亚克隆及表达以重组质粒pT-FcRn为模板,利用PCR方法亚克隆得到FcRn-CT基因片段,将目的基因分别连接到载体pGEX-KG和pET-32a（+）上构建重组原核表达质粒（KG-CT和pET-32a-CT）,并成功在大肠杆菌中获得了表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析,结果显示分别出现了分子量大小为29 KDa和23 KDa的蛋白条带,与预期融合蛋白GST-CT和His-CT的分子量大小相符。3.兔抗猪FcRn多克隆抗体的制备与纯化利用纯化的融合蛋白GST-CT作为免疫原,His-CT作为检测原,按照设计好的免疫程序免疫家兔,成功制备了兔抗猪FcRn高免血清,用间接ELISA法检测血清抗体效价高达1：32000,并采用亲和层析法对所获得的高免血清进行了纯化。4.初步应用Western blot方法检测猪FcRn在黏膜上皮中的表达利用制备的兔抗猪FcRn高免血清,用Western blot方法检测猪FcRn在黏膜上皮中的表达情况。结果显示,在猪气管、肺、十二指肠、子宫、阴道等黏膜上皮中均有FcRn表达。5.应用免疫组织化学方法检测猪FcRn在黏膜上皮中的表达与分布利用纯化的兔抗猪FcRn多克隆抗体,建立了猪FcRn的免疫组织化学检测方法。结果显示,在猪子宫、阴道、鼻腔、气管、肺、十二指肠、空肠中均表达,且主要定位于子宫内膜上皮、阴道黏膜上皮、鼻腔前庭部和呼吸部黏膜上皮、气管黏膜上皮和气管腺、肺泡和细支气管黏膜上皮、十二指肠黏膜上皮、空肠黏膜上皮等部位。

论文目录

摘要

Abstract

缩略语（Abbreviation）

1 文献综述

1.1 FcRn的结构

1.2 FcRn的配体

1.3 FcRn与IgG的相互作用

1.4 FcRn的功能

1.4.1 FcRn维持血液中IgG和白蛋白水平的稳定

1.4.2 FcRn通过肠上皮转运母源lgG

1.4.3 FcRn通过胎盘和卵黄囊转运IgG

1.4.4 FcRn通过乳腺转运IgG

1.5 FcRn的研究进展

2 研究目的及意义

3 材料与方法

3.1 实验材料

3.1.1 载体及菌株

3.1.2 主要试剂

3.1.3 实验动物

3.1.4 试剂配制

3.2 实验方法

3.2.1 猪FcRn的克隆

3.2.2 FcRn-CT基因的亚克隆

3.2.3 原核表达质粒的构建

3.2.4 重组原核表达质粒的诱导表达

3.2.5 融合蛋白的纯化

3.2.6 多克隆抗体的制备及纯化

3.2.7 Western blot检测猪各组织的分布

3.2.8 免疫组化研究FcRn在猪各组织中的分布

4 实验结果

4.1 FcRn基因的克隆与序列分析

4.1.1 FcRn基因的RT-PCR扩增

4.1.2 FcRn基因的克隆、鉴定、测序及序列分析

4.2 FcRn-CT基因的亚克隆与序列分析

4.2.1 FcRn-CT基因的亚克隆

4.2.2 FcRn-CT基因的鉴定、测序及序列分析

4.3 融合蛋白的原核表达

4.4 重组蛋白的纯化

4.5 多克隆抗体的制备

4.5.1 间接ELISA测定抗体效价

4.5.2 Western blot检测抗体特异性

4.6 多克隆抗体的纯化及鉴定

4.7 Western blot检测猪黏膜上皮中的表达情况

4.8 SABC法检测FcRn在猪黏膜上皮中的分布研究

4.8.1 最佳反应条件的确定

4.8.2 FcRn在猪黏膜上皮中的分布情况

5 讨论

5.1 原核表达载体的选择

5.2 FcRn的序列

5.3 抗血清的制备

5.4 免疫组化中组织的选取及处理

5.5 FcRn在猪组织中的定位分析

6 结论

参考文献

附录

致谢

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