运用SRAP和SSR分子标记研究粉花石斛的遗传多样性和居群遗传结构

论文摘要

粉花石斛（Dendrobium loddigesii Rofle）是一种濒危的兰科石斛属多年生附生草本植物,具有很高的药用价值和观赏价值。粉花石斛的茎是一种传统的名贵中药材,具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、延年益寿等功效。粉花石斛的自然萌发率低且生长缓慢,加上人类的过度采挖,生境的恶化,该物种已经濒临灭绝。因此,亟待需要对该物种的遗传多样性和居群遗传结构进行研究,旨在为合理利用及保护粉花石斛资源提供科学依据。本论文首先利用序列相关扩增多态性（SRAP）分子标记初步探讨了9个粉花石斛野生居群的遗传多样性和居群遗传结构。通过正交试验设计对粉花石斛的SRAP-PCR反应体系进行优化确定最佳的反应体系,并筛选出多态性高、重复性好的引物组合。17对多态性SRAP引物在96个样本扩增后共得到231条条带。结果表明,粉花石斛拥有较高的遗传多样性水平,其中多态性条带有187条,平均多态位点百分比（PPB）为80.52%,平均基因杂合度（H）为0.2743,平均香农信息指数（Ⅰ）为0.4113。遗传分化指数（Gst=0.304）表明粉花石斛居群间存在中等水平的遗传分化。UPGMA聚类分析表明9个居群分为两大支,第一大支贵州茂兰（ML）、广西4个居群（HC, LY, LA, YL）和广东2个居群（SG和YD）,第二大支包括海南白沙居群（BS）和云南红河（HH）居群。PCA分析的结果和聚类分析的结果相一致。Mantel test检测表明遗传距离和地理距离之间没有明显正相关性。本论文还对粉花石斛的微卫星进行了开发。利用磁珠富集法构建粉花石斛微卫星文库,筛选出有效SSR标记,共获得12对多态性引物。通过对9个粉花石斛居群的95个个体的扩增发现：每个位点的等位基因数目（A）为3-22个,平均每个位点8.2个等位基因；多态信息含量（PIC）为0.358-0.838,平均多态信息含量是0.637;期望杂合度（He）为0.454-0.857,平均期望杂合度是0.690。这说明开发的12个微卫星位点具有较高的多态性和丰富的信息含量,可以为粉花石斛的遗传多样性和居群遗传结构的研究奠定基础。然后,利用开发的微卫星位点对粉花石斛的遗传多样性和居群遗传结构进行进一步分析。每个居群检测到的等位基因数目是2.62-4.58,每个居群的期望杂合度（He）是0.484-0.665,平均期望杂合度是0.582。结果亦表明粉花石斛具有较高的遗传多样性。AMOVA分析表明居群内的遗传变异占主要部分（82.02%）,居群间的变异占总变异的17.98%。聚类分析表明9个野生居群的96个个体分为两大类,且居群间的遗传距离和实际的地理距离没有明显相关性。SSR分析的结果跟SRAP分析结果一致。综上所述,本论文首次结合SRAP和SSR两种分子标记对粉花石斛的遗传多样性和居群遗传结构的进行研究,分析结果对濒危野生粉花石斛资源的合理保护有重要的意义。这两种分子标记也有助于粉花石斛的鉴别、遗传图谱构建、保护生态学和育种等研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 粉花石斛的特性以及研究进展
• 1.1.1 粉花石斛的资源与形态特征
• 1.1.2 化学成分研究
• 1.1.3 组织培养研究
• 1.1.4 遗传多样性研究及其鉴别
• 1.2 SRAP分子标记及其在植物研究中的应用
• 1.2.1 SRAP标记的原理
• 1.2.2 SRAP引物的选择
• 1.2.3 SRAP标记的特点
• 1.2.4 SRAP在植物中的应用
• 1.3 微卫星（SSR）技术及其在植物研究中的应用
• 1.3.1 SSR标记的原理
• 1.3.2 SSR标记的分类和分布
• 1.3.3 SSR标记的特点
• 1.3.4 SSR标记的获得方法
• 1.3.5 SSR标记在植物中的应用
• 第2章 SRAP标记研究粉花石斛的遗传多样性和居群遗传结构
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 基因组DNA提取
• 2.1.3 SRAP分析
• 2.1.4 数据分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 SRAP-PCR正交试验设计的扩增结果
• 2.2.2 模板DNA浓度的确定
• 2.2.3 SRAP引物筛选结果
• 2.2.4 遗传多样性和居群遗传结构分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 正交试验设计在粉花石斛SRAP-PCR反应体系优化中的应用
• 2.3.2 遗传多样性
• 2.3.3 居群遗传结构
• 2.3.4 保护策略考虑
• 第3章 粉花石斛微卫星标记的开发及多态性分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 基因组DNA提取
• 3.1.3 SSR的开发
• 3.1.4 SSR多态性位点分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 基因组DNA酶切结果
• 3.2.2 富集所得单链DNA的PCR扩增结果
• 3.2.3 单菌落的PCR检测
• 3.2.4 克隆测序结果
• 3.2.5 多态性位点检测分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 磁珠富集法的效率
• 3.3.2 微卫星多态性分析
• 第4章 SSR标记研究粉花石斛的遗传多样性和居群遗传结构
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 基因组DNA提取
• 4.1.3 SSR引物
• 4.1.4 SSR分析
• 4.2 结果与分析
• 4.3 讨论
• 4.3.1 遗传多样性和居群遗传结构
• 4.3.2 SRAP和SSR两种分子标记的比较
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表的学术论文及研究成果
• 致谢