炎症、氧化应激与动脉粥样硬化的关系及辛伐他汀抗炎、抗氧化作用的研究

论文摘要

背景:动脉粥样硬化所致的心、脑血管疾病是目前危害人类健康的首要疾病,其发病机制过去主要存在脂质浸润、血栓形成和损伤反应3种学说,1999年Ross提出动脉粥样硬化是一种炎症性疾病的理论逐渐取得人们的认同。近年的研究证实,粘附分子、细胞因子、生长因子和金属蛋白酶参与了动脉粥样硬化的发生发展的炎症过程,几乎所有动脉粥样硬化的传统危险因素都和炎症过程密切相关。血管粘附蛋白-1是20世纪80年代新发现的粘附分子,研究证实其在慢性炎症中被诱导或上调。目前血管粘附蛋白-1在动脉粥样硬化发生发展中的作用研究甚少。核转录因子-κB广泛存在于真核生物中,是一个由复杂的多肽亚单位组成的蛋白家族。近年研究显示,它与动脉粥样硬化等心血管疾病密切相关。上述炎症因子在激活后可促进动脉中膜平滑肌细胞的增殖和迁移,其在动脉粥样硬化斑块的形成中起重要作用。研究发现,氧化应激在血管病变形成中发挥重要作用。外源性的ROS刺激可以使配位基诱导的受体快速激活释放细胞内的O2·-和H2O2,而越来越多的研究证明内源性的ROS可以诱导血管平滑肌细胞原癌基因表达,促进细胞增殖。他汀类药物是目前治疗高胆固醇血症的一线药物,研究证明他汀除了降脂作用外还具有抗炎抗氧化等多种作用,这在许多基础研究和临床实验中均得到了不同程度的认识和肯定。但是他汀类对接受氧化应激刺激后的动脉炎症反应的影响尤其是血管粘附蛋白-1的表达未见报道。目的:1、探讨人动脉硬化血管中血管黏附蛋白-1、核因子-κB的表达水平,并分析两者的相互关系及与动脉硬化发生发展的关系;2、研究一定浓度过氧化氢对兔血管平滑肌的作用,探讨氧化应激与动脉硬化的关系;3、研究辛伐他汀对过氧化氢诱导的兔血管平滑肌细胞增殖的影响和对血管中血管黏附蛋白-1、核因子-κB表达的影响,探讨他汀的抗炎抗氧化作用。材料和方法:1、20例人主动脉血管标本根据HE染色结果分为动脉硬化组（15例）和正常对照组（5例）,应用免疫组织化学染色方法检测血管标本中炎症因子血管粘附蛋白-1、核因子-κB的表达水平,分析血管粘附蛋白-1、核因子-κB在两组表达中的差异,并探讨其病理意义。数据采用t检验和Spearman等级相关分析进行统计学分析。2、兔动脉血管平滑肌细胞用无血清的DMEM培养基培养24h使细胞进入静止期,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液,分别加入浓度为0、1、10、50、100、200μmol/L H2O2,每个浓度设6个复孔,以0μmol/L组为对照。上述各组分别于培养24h、48h、72h后,采用CCK-8法检测血管平滑肌细胞增殖情况;TBA法检测培养基中丙二醛含量,数据采用单因素方差分析进行统计学分析。3、兔动脉血管平滑肌细胞用无血清的DMEM培养基培养24h使细胞进入静止期,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液,分为①对照组;②过氧化氢刺激组,加入100μmol/L过氧化氢;③低浓度他汀干预组,加入100μmol/L过氧化氢溶液和辛伐他汀溶液10μmol/L;④高浓度他汀干预组,加入100μmol/L过氧化氢溶液和辛伐他汀溶液50μmol/L,分别于24h、48h、72h采用CCK-8法检测血管平滑肌细胞增殖情况;TBA法检测培养基中MDA含量,划痕法检测细胞迁移,实验终点免疫组化法检测血管粘附蛋白-1、核因子-κB的表达。数据采用单因素方差分析进行统计学分析。结果:1、人主动脉血管标本中炎症因子的表达血管粘附蛋白-1主要在动脉斑块中平滑肌细胞中表达,尤以斑块肩部最为明显。核因子-κB主要在动脉硬化血管的内皮细胞、炎细胞的细胞核上表达,平滑肌细胞也有表达,少数以未活化的形式位于细胞浆;血管粘附蛋白-1和核因子-κB均显色为棕黄色,正常血管对照染色核显蓝色。在动脉硬化血管中VAP-1阳性表达细胞计数为（17.54±9.86）/HP ,15例中有6例弱阳性表达,9例阳性表达。NF-κB阳性表达率为（28.31±8.62）/HP,其中6例阳性表达,9例强阳性表达。在5例正常血管中VAP-1仅血管外膜轻度着色,NF-κB有少量弱阳性表达或呈未活化状态,阳性表达率为（6.35±2.28）/HP。两组中血管粘附蛋白-1、核因子-κB的表达均有显著差异（P<0.05）;VAP-1和NF-κB的表达呈明显正相关（r=0.558,P= 0.004）。2、H2O2对VSMC的影响①H2O2对VSMC增殖的影响:10～100μmol/L的H2O2作用不同时间后,随H2O2浓度的增加,VSMC呈增殖趋势,与对照相比,H2O2浓度≤100μmol/L作用24h时,各组吸光度值无明显差异（P>0.05）,作用48h、72h后,各组吸光度值显著上升（P<0.01）;H2O2浓度为200μmol/L时,各时段吸光度值显著降低（P<0.01）;②H2O2促VSMC生成MDA:作用24h后,H2O2刺激组与对照组相比所测A值无显著差异;作用48h、72h后,与对照组相比,H2O2刺激组测得的A值随H2O2浓度的增加而增大,呈剂量依赖性;且作用72h所测A值大于48h（P<0.05）。3、辛伐他汀的抗炎抗氧化作用①抑制兔血管平滑肌细胞的增殖和迁移:加入不同浓度的辛伐他汀作用24h后,他汀干预组与对照组相比无显著差异（P>0.05）;作用48h后,两种浓度辛伐他汀组可抑制经过氧化氢诱导的兔血管平滑肌细胞增殖（P<0.01）;作用72h后,两种浓度辛伐他汀组均显著抑制兔血管平滑肌细胞增殖（P<0.01）,且高浓度辛伐他汀组作用大于低浓度辛伐他汀组（P<0.05）;加入不同浓度的辛伐他汀作用72h后可显著抑制由过氧化氢刺激引起的兔动脉血管平滑肌细胞迁移。②降低细胞培养液中MDA含量:两种浓度辛伐他汀作用48h和72h均显著抑制兔血管平滑肌细胞中MDA的水平（P<0.01）。作用72h后比48h的抑制作用更大,且两组辛伐他汀组间有显著差异（P<0.05）;③抑制核因子-κB表达:正常对照组中核因子-κB表达较低;培养基中加入过氧化氢时,兔血管平滑肌细胞中核因子-κB表达显著增加（P<0.01）,辛伐他汀可抑制这一表达,且高浓度组较低浓度组抑制作用更显著（P<0.05）。④对血管黏附蛋白-1的作用:免疫组化结果显示,血管黏附蛋白-1在四组中均轻度着色,无明显阳性结果,四组相比未见差异。结论:1、血管黏附蛋白-1、核因子-κB在动脉硬化斑块中有大量表达,且血管粘附蛋白-1与核因子-κB的表达呈明显正相关;2、一定浓度的过氧化氢可诱导兔血管平滑肌细胞的增殖,且能使细胞培养液中MDA水平升高;3、一定浓度的辛伐他汀可抑制过氧化氢诱导的兔血管平滑肌细胞增殖及迁移,并抑制核因子-κB的表达,减少细胞培养基中MDA含量,且与时间和剂量有关,但对血管粘附蛋白-1的表达无显著影响。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 1 动脉粥样斑块上炎症因子的表达
• 前言
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 附图
• 2 过氧化氢对兔血管平滑肌细胞的作用
• 前言
• 2.1 材料与仪器
• 2.2 实验方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 3 辛伐他汀对过氧化氢促兔血管平滑肌细胞增殖影响的实验研究
• 前言
• 3.1 材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 附图
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究结果
• 致谢