论文摘要
土壤盐碱化是影响农业生产和生态环境的严重问题,苜蓿既是改良土壤、保持水土的重要植物,同时又是重要的饲料作物。苜蓿转基因研究进行的较早、广泛也较成功。采用传统的育种方法,选育耐盐品种进展极为缓慢。随着分子生物学的发展,本课题研究是利用农杆菌介导法,将抗旱耐盐基因转入苜蓿中,从而可以提高苜蓿的耐盐碱性。本研究主要以苜蓿的无菌子叶作为外植体,诱导体细胞胚发生。通过对培养基成分等一些影响因素的优化,完成苜蓿愈伤组织诱导、愈伤组织的分化、出苗以及生根的整个再生过程。利用根癌农杆菌介导法对其进行抗旱耐盐基因遗传转化的研究,以期获得转基因植株并对其进行有关耐盐碱性生理指标的检测,取得的主要结果如下:1、本实验分别优化了苜蓿子叶节各个时期的培养基成分:（MS+2,4-D2.0mg/L+KT 0.25mg/L,蔗糖3%,pH5.8）培养基可诱导苜蓿可诱导苜蓿愈伤组织;在（MS+NAA 0.05mg/L+6BA 0.5mg/L,蔗糖3%,pH5.8）和MS、1/2MS（蔗糖1.5%,pH5.8）培养基上正常发育、萌发成苗以及生根。2、本实验利用农杆菌介导法将BADH和CMO双价耐盐基因导入苜蓿中,探讨了不同的侵染时间、不同的菌液的浓度等条件对转化效果的影响。结果表明,浓度（OD值）在0.3-0.5左右,侵染25分钟时的愈伤组织的侵染效果最好,转化率较高,并采用40mmol/L的含盐培养基对其进行筛选,转化过程中得到了抗性植株。3、对得到的抗性植株提取其叶片DNA进行PCR检测以及PCR-southern鉴定,结果表明,PCR检测为阳性的两个单株均有与阳性对照大小完全一致的杂交带出现,与PCR检测结果完全吻合,而非转基因植株没有杂交信号出现,说明PCR产物确实是BADH基因,而不是苜蓿基因组中的同源序列,从而证明外源基因BADH和CMO已成功的整合到基因组中。4、本实验对转基因阳性植株进行了耐盐性生理指标检测,分别为甜菜碱含量的对比测定、细胞膜透性、游离脯氨酸含量、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性以及过氧化物酶活性。结果表明:甜菜碱、膜透性脯氨酸含量和丙二醛含量随着盐胁迫的增强在增加,且都高于无盐胁迫下的值,而SOD,POD活性则正相反,随着盐胁迫的减弱其活性逐渐减小,并且随着胁迫天数的增加逐渐下降。对转化苗在浓度为1.0%的碱性盐水浇灌条件下,定期测其生理指标,并与非转化苗的指标作对比,发现其甜菜碱的含量有所增加,但是其细胞膜透性、丙二醛含量有着明显的降低,而超氧化物歧化酶活性以及过氧化物酶活性有明显的提高,但对于脯氨酸二者则没有显著的差别。综上所述:外源基因BADH和CMO已有效地整合到转基因阳性植株基因组中,并成功的获得了表达,从而使转基因阳性植株的抗旱耐盐碱性得到了提高。