论文摘要
目的：研究2、4、6GyX射线照射后不同时间点A549细胞中Bmi-1基因mRNA和蛋白的表达变化。利用RNAi技术抑制Bmi-1基因的表达，观察A549细胞的增殖，探讨RNAi对放射敏感性的影响。方法：用不同剂量（2、4、6Gy）X射线照射体外培养的人肺癌A549细胞株，分别采用实时荧光定量PCR技术和Western blot技术检测A549细胞照射0、6、12、24、48和72h后Bmi-1mRNA和蛋白的表达水平。利用慢病毒表达体系pLP1/pLP2/VSVG/表达质粒构建针对Bmi-1系列的siRNA重组质粒，稳定转染A549细胞株，流式细胞仪筛选稳定株，采用荧光实时定量PCR技术和Western blot技术检测干扰后Bmi-1基因的表达。采用MTT法和细胞克隆形成实验检测siRNA干扰Bmi-1基因表达后对A549细胞放射敏感性的影响。结果：1Bmi-1基因mRNA在X射线照射下的表达变化。2、4、6Gy X射线照射A549细胞后一定时间内Bmi-1mRNA表达升高。与0h组相比，照射后的48h（除2Gy组）内Bmi-1mRNA表达差异有统计学意义（-8.64≤t≤-2.90，0.001≤P≤0.04）。2Bmi-1基因蛋白在X射线照射下的表达变化。A549细胞Bmi-1蛋白在照射后48h内表达升高，48h后蛋白表达逐渐下降，至72h时接近未照射组水平。与0h组相比，大部分时间点（除4Gy48h和72h外）的蛋白表达差异具有统计学意义（-10.5<t<3.77,0.001<P<0.05）。3siRNA干扰Bmi-1基因表达对肺癌A549细胞放射敏感性的影响。构建A549/Bmi-1-siRNA1、A549/Bmi-1-siRNA2、A549/Bmi-1-siRNA3、 A549/pSicoR-siRNA重组质粒,转染A549细胞株，流式细胞分选术分选出稳定表达GFP绿色荧光的细胞株，实时荧光定量PCR技术检测出A549/Bmi-1-siRNA3干涉效果最好，相对表达量为0.27±0.02，显著低于对照组、 A549/pSicoR-siRNA、 A549/Bmi-1-siRNA1、A549/Bmi-1-siRNA2，而A549/pSicoR-siRNA的干扰效率与对照组相比无统计学差异。Western blot蛋白印迹技术检测对照组、A549/pSicoR-siRNA、A549/Bmi-1-siRNA3干涉效果，结果显示A549/Bmi-1-siRNA3蛋白表达显著低于对照组和A549/pSicoR-siRNA，与其他两组相比具有统计学差异（P<0.05）。MTT法检测A549、A549/pSicoR-siRNA、A549/Bmi-1-siRNA3、A549+照射组、A549/pSicoR-siRNA+照射组、A549/Bmi-1-siRNA3+照射组培养1d、2d、3d、4d后细胞的增殖情况，单纯转染组A549/Bmi-1-siRNA3与A549组相比在3—4d内细胞增殖能力受到抑制（P<0.05）。单纯照射组3—4d内的增殖能力逐渐上升，但与A549组相比细胞增殖能力受到抑制（P<0.05）。A549/Bmi-1-siRNA3+照射组3—4d内的增殖能力受到显著抑制，低于单纯转染组和单纯照射组（P<0.05）。细胞克隆形成实验发现A549组、A549/pSicoR-siRNA、A549/Bmi-1-siRNA3细胞随着放射剂量的增加克隆形成率和生存率逐渐降低，A549未处理组和A549/pSicoR-siRNA组之间克隆形成率无统计学差异（P>0.05），A549/Bmi-1-siRNA3克隆率与细胞生存率在2、4、6Gy照射时较其它两组下降（P<0.05）。同时存活曲线显示A549/Bmi-1-siRNA3较其它两组左移，说明Bmi-1-siRNA可提高A549细胞的放射敏感性。结论：1. A549细胞Bmi-1基因mRNA在2、4、6Gy X射线照射后48h内Bmi-1mRNA表达升高。2.26Gy剂量X射线照射可使人肺癌A549细胞Bmi-16h时开始升高,24h的蛋白相对表达量最高（除4Gy外），24h至48h内表达逐渐下降但均高于对照组，72h的蛋白相对表达量接近未照射组水平。3.筛选的siRNA可有效下调Bmi-1基因的表达。Bmi-1-siRNA能降低肺癌A549细胞的增殖能力和存活率，提高肺癌的放射敏感性。
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