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正清风痛宁联合甲氨蝶呤干预类风湿关节炎骨破坏的机制研究

2020-12-15阅读(518)

正清风痛宁联合甲氨蝶呤干预类风湿关节炎骨破坏的机制研究

论文摘要

目的1.确认正清风痛宁和甲氨蝶呤单用及联用对于RA骨破坏的抑制作用强度；2.从炎症及RANKL系统解释正清风痛宁联合甲氨蝶呤对抗骨破坏的可能机制。方法1.酶消化法进行RA滑膜成纤维细胞原代培养,本实验采用5-10代滑膜成纤维细胞。分为4组并作以下处理：空白对照组,MTX组（浓度0.1mg/ml）,正清风痛宁组（浓度0.1mg/ml）,联合组（正清风痛宁+MTX,各加浓度0.1mg/ml）。采用苏木精—伊红染色比较不同药物对滑膜成纤维样细胞组织形态学的影响；流式细胞术检测不同药物对滑膜成纤维样细胞凋亡的影响；RT-PCR测定RANKL mRNA的表达。2.建立Ⅱ型胶原蛋白诱导的SD大鼠关节炎模型,随机分为模型组（生理盐水灌胃）、MTX组（3.8mg/kg/w灌胃）、联合组（正清风痛宁+MTX组,正清风痛宁130mg/kg/d和MTX 3.8mg/kg/w灌胃）,另设7只作为正常对照组。采用关节评分法评估关节炎症程度,并用ELISA法分析大鼠血清中OPG、RANKL、IL-lα、IL-6、MMP-3, MMP-13的表达水平。结果1.加药组对滑膜细胞组织形态学的改变,光镜下见滑膜细胞出现凋亡表现,形态异常；荧光显微镜下见滑膜细胞出现核质浓集,有明显的凋亡小体。2.加药组对滑膜细胞增殖均有不同程度的抑制作用,流式细胞仪检测结果显示：空白对照组25.3%,MTX组28.4%,正清风痛宁组32.3%,联合组34.7%,说明加药组凋亡细胞百分率均明显高于空白对照组。3.RT-PCR结果显示：各组RANKL电泳条带均较空白组弱；联合组OPG电泳条带较空白组强。相对灰度值计算结果显示,联合组与其余各组相比,其RANKL比值最小,OPG比值最大；MTX组与正清风痛宁组之间比值相似。4.造模后,大鼠关节炎肿胀程度在第21d最为明显,然后逐渐消退,在第35d左右会出现第2个炎症高峰,MTX组和联合组均可减轻关节肿胀,关节炎指数评分在第46d与造模组比较差异有统计学意义（P≤0.05）。5.与模型组比较,MTX组和联合组均可明显抑制大鼠血清IL-1α、IL-6的表达水平,与MTX组相比联合组血清IL-1α、IL-6的表达水平显著降低,差异有统计学意义（P≤0.05）；MTX组和联合组都可明显抑制血清MMP-3和MMP-13的表达水平,同时联合组血清MMP-3的表达水平低于MTX组,差异有统计学意义（P≤0.05）。6.与模型组比较,MTX组、联合组均提高OPG的表达水平,升高OPG与RANKL的比值；联合组可降低血清RANKL的表达水平,差异有统计学意义（P≤0.05）；联合组与MTX组比较,血清RANKL的表达水平下降更为明显,OPG与RANKL的比值也有显著上升,差异有统计学意义（P≤0.05）。结论1.对体外培养的RA患者成纤维细胞研究发现,正清风痛宁与MTX联合体外给药能够协同促进滑膜成纤维细胞凋亡,并且对RANKL及OPG mRNA的表达有显著影响,说明正清风痛宁联合MTX能够促进滑膜成纤维细胞凋亡,并影响OPG-RANKL系统的平衡调节。2.对CIA大鼠诱导的关节炎模型病变的研究发现,正清风痛宁与MTX联合给药对CIA大鼠关节肿胀有明显的防治效应,能够较好地控制炎症发生发展,可能与其对血清IL-lα、IL-6等炎性因子的抑制作用有关；正清风痛宁与MTX可协同延缓骨破坏的发生,可能与其通过对MMP-3、MMP-13的抑制,以及提高OPG/RANKL的比例有一定关系。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 前言
  • 第一部分 理论研究
  • 1. 中医学对类风湿性关节炎的认识
  • 1.1 中医病名探讨
  • 1.2 中医病因病机研究
  • 1.3 中医治疗
  • 2. 西医学对类风湿关节炎的认识
  • 2.1 类风湿性关节炎的特征
  • 2.2 类风湿关节炎骨破坏机制的研究进展
  • 2.3 类风湿性关节炎的治疗进展
  • 3. 青风藤治疗RA的作用机制以及对骨破坏抑制作用的研究进展
  • 3.1 镇痛、抗炎、免疫抑制作用
  • 3.2 骨破坏抑制作用
  • 4. 青风藤联合甲氨蝶呤治疗RA骨破坏的研究进展
  • 4.1 青风藤对RA的治疗
  • 4.2 青风藤联合甲氨蝶呤对RA骨破坏的治疗及预防作用
  • 第二部分 正清风痛宁联合MTX对RA患者滑膜细胞凋亡及其RANKL表达的影响
  • 1 材料与设备
  • 1.1 主要试剂与仪器设备
  • 2 主要实验方法
  • 2.1 RA患者滑膜成纤维细胞的分离培养
  • 2.2 滑膜细胞冻存和复苏
  • 2.3 流式细胞仪检测细胞生长周期
  • 2.4 RT-PCR法检测RANKL mRNA表达水平的改变
  • 3 统计学处理
  • 4 结果
  • 4.1 光镜和荧光显微镜下观察滑膜细胞形态
  • 4.2 流式细胞仪检测滑膜细胞凋亡
  • 4.3 滑膜细胞RANKL及OPG mRNA的表达
  • 附图
  • 5 讨论
  • 第三部分 正清风痛宁抑制大鼠胶原性关节炎骨破坏的实验研究
  • 1 材料与设备
  • 1.1 实验动物
  • 1.2 主要试剂与器材
  • 2 方法
  • 2.1 模型建立
  • 2.2 整体疗效及关节炎指数评分
  • 2.3 细胞因子测定
  • 3 结果
  • 3.1、 SD人鼠模型关节肿胀度评分
  • 3.2、 血清RANKL和OPG水平的表达
  • 3.3、 血清IL-1α和IL-6水平的表达
  • 3.4、 血清MMP-3和MMP-13水平的表达
  • 4 讨论
  • 结语
  • 参考文献
  • 附录 英文缩略词
  • 攻读硕士学位期间取得的学术成果
  • 致谢

    • 相关论文文献

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