论文摘要
随着工业的快速发展,大量的工业废水被排放到环境中,使得水体重金属污染越来越严重,重金属污染不仅对生态平衡构成极大的威胁,还能直接或间接影响人类的健康。金属硫蛋白（MT）的合成受金属离子的诱导,该诱导作用通过调节MT的转录水平实现,MT是一类富含半胱氨酸的蛋白质,其半胱氨酸上的巯基对重金属离子有极强的结合力,能够结合重金属形成无毒或低毒的络合物,具有解除重金属毒性的功能。本文以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因,构建金属硫蛋白重组表达载体转化毕赤酵母,研究工程菌株对重金属胁迫的荧光响应及对重金属的抗性。以酿酒酵母基因组DNA为模板,PCR扩增获得金属硫蛋白启动子Pcup1片段,将其替换载体pPIC9K上原有的启动子PAOXI,构建重组载体pCUP9K;以质粒pYX112-GFP为模板,PCR扩增获得GFP基因序列,插入pCUP9K的多克隆位点,构建重组表达载体pCUP9K-GFP;采用重叠延伸PCR技术,以质粒pGEM-T-AsMT2b和pYX112-GFP为模板,设计特异性引物,分别PCR扩增获得AsMT2b和GFP基因,再将两者准确拼接获得融合基因,构建重组表达载体pCUP9K-AsMT2b-GFP和pPIC9K-AsMT2b-GFP。将构建成功的重组表达载体单酶切线性化,用氯化锂法分别转化毕赤酵母GS115,获得工程菌株GS115-1 （pCUP9K-GFP）、GS115-2 （pCUP9K-AsMT2b-GFP）和GS115-3 （pPIC9K-AsMT2b-GFP）。荧光显微镜下用波长460-480 nm的蓝光照射,可以观察到工程菌菌体发出的绿色荧光,而对照菌没有发出荧光,表明GFP在工程菌中获得正确表达。分离工程菌的发酵上清液,用荧光分光光度计进行扫描,结果显示在激发波长为475 nm时,508 nm处有一发射峰,其光谱特征与GFP一致,表明工程菌能够将胞内表达的GFP分泌至胞外。将工程菌GS115-1置于含有不同重金属（铜、铬、镉、砷）离子的培养液中,在一定时间后检测其发酵上清液的荧光值,结果表明,工程菌对铜离子有明显的荧光响应,且荧光强度与铜离子浓度（0-1000μM）呈正相关,可以通过进一步改进工艺和参数,由工程菌的荧光强度来指示水体中铜离子的相对含量。在培养液中分别添加铜离子和甲醇,对工程菌GS115-2和GS115-3进行诱导,取发酵上清液经SDS-PAGE电泳,检测到目的蛋白AsMT2b-GFP,该结果进一步说明工程菌能够将胞内表达的外源蛋白分泌至胞外。用含不同重金属（铜、铬、镉、砷）的平板培养工程菌GS115-2和GS115-3,检测工程菌对重金属的抗性,结果表明工程菌对铜、铬、镉的抗性明显增强,而对砷的抗性没有明显改善,说明转AsMT2b基因工程菌过表达AsMT2b能够增强宿主对铜、铬、镉的抗性。