华蟾素及其活性成分蟾毒灵和华蟾毒精诱导肝癌细胞凋亡的机制探讨

论文摘要

研究背景原发性肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率呈逐年上升趋势,严重威胁着人类的健康。目前,手术切除仍是肝癌早期治疗的首选方案,但是很多患者在确诊时已发展到晚期,失去了最佳手术治疗时机,只能依赖于非手术治疗包括放疗、化疗等。然而,现有的化学药物在杀灭癌细胞的同时对人体正常细胞亦会造成损害；另外,肝癌普遍对化疗药物具有耐药性、不敏感的特点,而且容易复发及发生转移。因此,寻找高效、低毒副作用的治疗药物并明确其作用机制有着重大的临床意义。近年来,随着中医药研究的不断深入,中医药用于肝癌的防治在世界范围内越来越受到关注。华蟾素是中华大蟾蜍皮经过水化萃取而成的中药制剂,具有清热解毒,利水消肿,化瘀溃坚等作用,目前是我国临床上应用较广泛的一种中药抗肿瘤制剂,对于各种中、晚期恶性肿瘤尤其是原发性肝癌、肺癌、胰腺癌等的治疗有良好的疗效。近年来,随着对蟾蜍皮药理研究的进一步深入,已分离出其主要活性成分为蟾毒内酯类化合物,属强心苷类物质,包括蟾毒灵、华蟾毒精、华蟾毒精等,由于华蟾素来源于蟾蜍皮,其活性成分应该与蟾蜍皮类似。临床及基础实验研究证实,华蟾素及蟾蜍皮的活性成分对多种人肿瘤细胞有不同程度的抑制增殖、诱导分化、促进细胞凋亡、抑制血管生成等作用。但是,华蟾素亦存在着中药制剂普遍固有的缺点,即其有效活性成分及抗肿瘤作用机制不明确。因此,分离、纯化华蟾素的有效活性成分,并阐明华蟾素及其有效活性成分的抗肿瘤作用机制,对于提高华蟾素临床用药的准确性,以及改善剂型或开发新型抗肿瘤药物等均具有重大意义。细胞凋亡是一种细胞主动性死亡模式,在肿瘤的形成和演变过程中起着重要的作用。多种蛋白或酶包括Bcl-2蛋白家族,死亡受体超家族,及半胱天冬酶家族（caspase）等均参与了细胞凋亡的启动与实施,这些关键蛋白或酶异常表达和功能改变不仅与肿瘤的发生发展密切相关,而且影响肿瘤的治疗效果及预后。目前,通过控制凋亡通路中的关键分子的表达,诱导肿瘤细胞凋亡,已成为肿瘤治疗学的研究热点之一。细胞凋亡通路相对比较复杂,存在多种信号转导途径。目前,已知有两种经典的信号通路,即死亡受体介导的外源性信号通路和线粒体参与的内源性信号通路。在死亡受体介导的外源性途径中,死亡受体超家族成员（如Fas, TNF-R1,Apo-2）的受体与配体结合后,可促使受体聚合成三聚体而激活,在细胞内连接分子的介导下,激活caspase-8或caspase-10,进而激活caspase-3,引起细胞凋亡；在线粒体介导的内源性途径中,在细胞凋亡信号的刺激下,细胞色素c从线粒体释放到胞浆中,与细胞凋亡蛋白酶活化因子1（Apoptotic protease activating fator-1,Apaf-1）结合,在dATP存在的条件下形成多聚体,并通过胱冬肽酶募集结构域（caspase recruitment domains, CARD）募集激活caspase-9,继而激活caspase-3,启动caspase级联反应,引起细胞凋亡。Bcl-2家族蛋白,是编码能抑制或激活凋亡的膜结合蛋白,在线粒体介导的内源性凋亡通路中起着重要的作用,Bcl-2和Bcl-xL主要分布于线粒体膜和细胞质中,具有拮抗细胞凋亡的作用；Bax和Bid等分布于细胞质中,具有促进细胞凋亡的作用。促凋亡蛋白Bax和Bid在凋亡信号的刺激下可以从细胞质转移到线粒体膜上,引起线粒体膜电势能的下降,进而细胞色素c从线粒体释放到胞浆中,从而启动线粒体介导的细胞凋亡；抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL可以通过阻止促凋亡蛋白Bax和Bak在线粒体膜上的作用而抑制细胞凋亡。另外,BH3结构域凋亡诱导蛋白Bid被认为是死亡受体介导的外源性通路和线粒体介导的内源性通路的桥梁,被死亡受体通路激活的caspase-8或者caspase-10可以进而把Bid切割成有活性的tBid,使tBid从细胞质转移到线粒体膜上,引起线粒体膜电势能的下降,进而细胞色素c从线粒体释放到胞浆中,从而启动caspase级联反应,促使细胞凋亡体内、外实验研究表明华蟾素及其活性成分蟾毒灵、华蟾毒精等对白血病、膀胱癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤均有一定的作用,主要通过调控细胞凋亡相关因子（如Bcl-2、Bcl-XL、Bax,p53）的表达诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖,但是关于其诱导肝癌细胞凋亡的机制研究报道尚少,且诱导肝癌细胞凋亡的通路不明确。因此,本研究在前期华蟾素抗肿瘤研究的基础上,首先对华蟾素的有效活性成分进行了初步的分离和纯化,并探讨了华蟾素及其活性成分蟾毒灵、华蟾毒精诱导肝癌细胞凋亡的作用机制,探讨其是否可以通过调控线粒体介导的内源性凋亡途径或者死亡受体介导的外源性凋亡途径诱导肝癌细胞发生凋亡,进而发挥抗肝癌作用,以期为肝癌的治疗提供新的思路。现将各部分的主要内容介绍如下：第一部分中华大蟾蜍皮水溶性提取物华蟾素有效活性成分的初步分离鉴定目的：筛选和鉴定华蟾素中具有抗肝癌作用的有效活性成分方法：采用活性追踪分离的方法对华蟾素中具有抗肝癌作用的有效活性成分进行分离和活性检测。用氯仿萃取、硅胶柱层析、TLC薄层色谱法以及高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography,HPLC）对华蟾素的各组分进行提取分离,同时用细胞活性检测法检测从华蟾素中分离出的不同组分对HepG2细胞增殖抑制作用,以期分离出最有效的活性化合物；采用核磁共振（Nuclear magnetic resonance,NMR）和电子电离质谱（Electron Impact Mass Spectrometry, EI-MS）技术鉴定活性化合物的结构。结果：经过一系列的活性追踪分离实验,从华蟾素中分离出两种具有较强的抗肝癌活性化合物,经NMR和EI-MS鉴定及参考已经发表的相关文献确定这两种化合物分别为华蟾毒精和脂蟾毒配基。细胞活性实验结果显示华蟾毒精对HepG2细胞增殖抑制作用较脂蟾毒配基强。结论：脂蟾毒配基和华蟾毒精是华蟾素中具有抗肝癌作用的有效活性成分,且华蟾毒精比脂蟾毒配基具有更强抗肝癌活性。第二部分华蟾素诱导人肝癌细胞株HepG2细胞和Bel-7402细胞凋亡的作用机制探讨目的：探讨中华大蟾蜍皮提取物华蟾素诱导人肝癌细胞株HepG2细胞和Bel-7402细胞凋亡的作用机制。方法：将不同浓度华蟾素作用于HepG2细胞和Bel-7402细胞,用细胞活性检测法对华蟾素HepG2和Bel-7402细胞增殖抑制作用进行测定；用Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡的形态学改变；用流式细胞术观察细胞的凋亡率的变化；用MitoCapture Mitochondrial Apoptosis Detection kit检测线粒体电势能膜电位的变化；用Caspase Colorimetric Assay kits检测caspase-3,caspase-9,caspase-8和caspase-10的活性；用Western Blot analysis检测凋亡相关分子Bax、Bcl-2、Fas,细胞色素c,caspase-3,caspase-9,caspase-8,caspase-10,多聚ADP核糖聚合酶（poly（ADP-ribose）polymerase,PARP）及cleaved PARP的表达情况。结果：华蟾素对体外培养的肝癌HepG2细胞和Bel-7402细胞有抑制增殖作用,且具有剂量、时间相关性；细胞呈现体积缩小,核质浓缩及核膜核仁破碎等形态学变化,细胞凋亡率随药物浓度增加亦呈增长趋势；并且随华蟾素浓度的增加,Bcl-2的蛋白表达减弱,Bax的蛋白表达增强,且Bax/Bcl-2的比率增加,引起线粒体电势能的下降,促使细胞色素c从线粒体释放到胞浆,caspase-9和caspase-3被激活,进而caspase-3的底物PARP被切割,诱发DNA的断离及细胞凋亡；死亡受体家族成员Fas的蛋白表达随华蟾素浓度的增加亦增强,激活caspase-8或caspase-10,进而激活caspase-3,引起细胞凋亡；此外,胞浆中Bid的蛋白表达减弱,Bid被切割为tBid,这提示线粒体介导的内源性凋亡途径或者死亡受体Fas介导的外源性凋亡途径均参与了华蟾素诱导肝癌细胞凋亡。结论：华蟾素可以通过线粒体介导的内源性凋亡途径及死亡受体Fas介导的外源性凋亡途径诱导肝癌细胞株HepG2细胞和Bel-7402细胞凋亡第三部分华蟾素有效活性成分蟾毒灵和华蟾毒精诱导人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的作用机制探讨目的：探讨中华大蟾蜍皮提取物华蟾素的有效活性化合物蟾毒灵和华蟾毒精诱导人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的作用机制。方法：将不同浓度蟾毒灵和华蟾毒精作用于HepG2细胞,用细胞活性检测法检测蟾毒灵和华蟾毒精对HepG2细胞的增殖抑制作用；用Hoechst 33258染色法观察HepG2细胞凋亡的形态学改变；用流式细胞术观察细胞的凋亡率的变化；用MitoCapture Mitochondrial Apoptosis Detection kit检测线粒体电势能膜电位的变化；用Caspase Colorimetric Assay kits检测caspase-3,caspase-9,caspase-8和caspase-10的活性；用Western Blot analysis检测凋亡相关分子Bax、Bcl-2、Fas,细胞色素c,Bid,caspase-3,caspase-9,caspase-8,caspase-10,PARP及cleaved PARP的表达情况。此外,为了进一步探讨caspase蛋白在蟾毒灵和华蟾毒精诱导人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡中的作用,在给予HepG2细胞蟾毒灵和华蟾毒精处理的同时给予不同的caspase阻断剂处理（caspase-3阻断剂Z-DEVD-FMK,caspase-8阻断剂Z-IETD-FMK,caspase-9阻断剂Z-LEHD-FMK,caspase-10阻断剂Z-AEVD-FMK）,然后用Hoechst 33258染色法和流式细胞术观察细胞的凋亡变化,用Caspase Colorimetric Assay kits检测caspase-3,caspase-9,caspase-8和caspase-10的活性变化,用Western Blot analysis检测凋亡相关分子Bax、Bcl-2、Fas,细胞色素c,caspase-3,caspase-9,caspase-8, caspase-10,PARP及cleaved PARP的表达变化情况。结果：蟾毒灵和华蟾毒精对体外培养的肝癌HepG2细胞有抑制增殖作用,且具有剂量、时间相关性；细胞呈现体积缩小,核质浓缩及核膜核仁破碎等形态学变化,细胞凋亡率随药物浓度增加亦呈增长趋势；并且随蟾毒灵和华蟾毒精浓度的增加,Bcl-2的蛋白表达减弱,Bax的蛋白表达增强,且Bax/Bcl-2的比率增加,引起线粒体电势能的下降,促使细胞色素c从线粒体释放到胞浆,caspase-9和caspase-3被激活,进而caspase-3的底物PARP被切割,诱发DNA的断离及细胞凋亡；死亡受体家族成员Fas的蛋白表达随蟾毒灵和华蟾毒精浓度的增加亦增强,激活caspase-8或caspase-10,进而激活caspase-3,引起细胞凋亡；此外,胞浆中Bid的蛋白表达减弱,Bid被切割为tBid,这提示线粒体介导的内源性凋亡途径或者死亡受体Fas介导的外源性凋亡途径均参与了蟾毒灵和华蟾毒精诱导肝癌细胞凋亡。给予HepG2细胞不同的caspase阻断剂处理后,蟾毒灵和华蟾毒精诱导的HepG2细胞凋亡均可被这些阻断剂阻断,尤其是被caspase-10阻断剂阻断。结论：蟾毒灵和华蟾毒精均可以通过线粒体介导的内源性凋亡途径及死亡受体Fas介导的外源性凋亡途径诱导肝癌细胞株HepG2细胞凋亡,并且死亡受体Fas介导的caspase-10依赖途径发挥着更为重要的作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 文献综述
• 前言
• 1. 华蟾素的来源
• 2. 华蟾素抗肿瘤作用的研究现状
• 3. 蟾蜍皮有效活性成分抗肿瘤机制研究现状
• 4. 结论
• 参考文献
• 第一部分 中华大蟾蜍皮水溶性提取物华蟾素有效活性成分的初步分离鉴定
• 1. 研究背景及目的
• 2. 材料与方法
• 3. 结果
• 3.1. 华蟾素各分离组分的活性检测及活性化合物的分离
• 3.2. 华蟾素活性化合物的结构鉴定
• 3.3. 脂蟾毒配基和华蟾毒精的药物活性
• 4.讨论
• 5.结论
• 参考文献
• 第二部分 华蟾素诱导人肝癌细胞株HepG2细胞和Bel-7402细胞凋亡的作用机制探讨
• 1. 研究背景及目的
• 2. 材料与方法
• 3. 结果
• 3.1. 华蟾素抑制人肝癌细胞增殖的作用
• 3.2. 华蟾素对凋亡HepG2细胞和Bel-7402细胞形态学改变的影响
• 3.3. 华蟾素对HepG2细胞和Bel-7402细胞凋亡率的影响
• 3.4. 华蟾素对HepG2细胞和Bel-7402细胞线粒体膜电位的影响
• 3.5. 华蟾素对HepG2细胞和Bel-7402细胞caspase活性的影响
• 3.6. 华蟾素对HepG2细胞和Bel-7402细胞凋亡相关因子蛋白表达的影响
• 4.讨论
• 5.结论
• 参考文献
• 第三部分 华蟾素有效活性成分蟾毒灵和华蟾毒精诱导人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的作用机制探讨
• 1. 研究背景及目的
• 2. 材料与方法
• 3. 结果
• 3.1. 蟾毒灵和华蟾毒精抑制人肝癌细胞增殖的作用
• 3.2. 蟾毒灵和华蟾毒精诱导人肝癌细胞凋亡的形态学变化及细胞凋亡率
• 3.3. 蟾毒灵和华蟾毒精对HepG2细胞线粒体膜电位的影响
• 3.4. 蟾毒灵和华蟾毒精对HepG2细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及细胞色素c的影响
• 3.5. 蟾毒灵和华蟾毒精诱导HepG2细胞的caspase、Bid、PARP的激活以及Fas的表达上调
• 3.6. Caspase阻断剂在蟾毒灵和华蟾毒精诱导的HepG2细胞凋亡中的作用
• 4.讨论
• 5.结论
• 参考文献
• 论文总结与展望
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 已发表的代表性论文
• 论文1
• 论文2
• 论文3
• 论文4
• 论文5
• 学位论文评阅及答辩情况表