论文题目: 家蝇蛆抗菌肽的分离纯化和性质研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 陆婕
导师: 陈正望
关键词: 家蝇蛆,果蝇蛆,抗菌肽,杀菌活性,抗癌活性,细胞膜穿孔,离子通道,扫描电镜,膜片钳,胞内荧光测钙
文献来源: 华中科技大学
发表年度: 2005
论文摘要: 家蝇（Musca domestica）属昆虫纲,双翅目,环裂亚目、蝇科,是我国大部分地区最常见、数量最多的一种蝇类。家蝇中存在大量抗菌活性物质,对抗菌药物的开发具有重要的意义。但家蝇中抗菌肽的种类较多,成分复杂,很难分离纯化出一个单一抗菌肽,目前国内外对其研究较少。本研究从家蝇干蝇蛆中分离纯化出了一个新抗菌肽Muscatoxin并测得其氨基酸序列,也深入开展了生理功能的研究。完成的工作主要包括以下几个方面:1、利用短时沸水处理、稀醋酸低温浸提、海藻酸吸附、稀盐酸低温洗脱、盐析、凝胶过滤、CMC23弱阳离子交换柱层析、反相高效液相色谱层析等方法,从家蝇蛆中分离纯化出一组蝇蛆抗菌肽,具有抗菌谱广,最低杀菌浓度低,耐热、耐冻融能力极强等特点。其杀菌活性高低依次为:枯草杆菌＞苏云金芽胞杆菌＞金黄色葡萄球菌＞铜绿假单孢菌＞大肠杆菌,最低杀菌浓度依次为:0.039、0.078、1.25、5.0、20.0μg/μl。蝇蛆抗菌肽不是凝集素类物质,对G+菌的杀灭作用比对G-菌强,对抗菌药物的开发有重要意义。此外,蝇蛆抗菌肽中存在的大量弱酸性蛋白也有杀菌活性。2、结合反相高效液相色谱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳和电洗脱回收等方法,首次在蛋白质水平上,从蝇蛆抗菌肽中分离纯化出一个高纯度的新抗菌肽Muscatoxin,分子量7095 D,等电点8.88,肽质量指纹谱（PMF）分析表明其为一新肽,Edman降解测得其N端40个氨基酸序列为SQLGDLGSGA GKGGGGGGSI REAGGAFGKLEAAREEEYFY,N端有六联体的Gly、二联体的Gly和三联体的Glu结构域,可归类于富含Gly的抗菌肽。Muscatoxin可能存在蛋白质翻译后修饰。3、经GeneBank数据库查询,Muscatoxin是一个未曾报道过的新肽,其基因在原核生物和真核生物中都有。此序列与基因库中由果蝇Drosophila melanogaster的NM166597和AY071315基因推导拟蛋白的24～63aa同源性达97.5%,序列高度一致,仅第三位Val变成了Leu（这两种氨基酸的疏水性质很相似）:果蝇中该拟蛋白的序列是从基因序列推导而来的,我们首次从蛋白质水平上分离纯化出了该多肽。4、采用扫描电镜技术,发现蝇蛆抗菌肽Muscatoxin能破坏G+菌（枯草杆菌、苏云金芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌）和G-菌（铜绿假单孢菌、大肠杆菌）的细胞膜,使其形成穿孔,原生质泄漏而死亡;5、蝇蛆抗菌肽Muscatoxin能杀灭单核白血病癌细胞（THP-1）。经Muscatoxin（2mg/ml）处理后,白血病癌细胞的贴壁性很快被破坏,大量细胞悬浮并死亡。扫描电镜观察发现,悬浮细胞的细胞间质明显减少,细胞形态发生变化,细胞膜出现大量穿孔、原生质泄漏,细胞破裂死亡。Muscatoxin对癌细胞和细菌的杀灭机制相同:6、蝇蛆抗菌肽Muscatoxin有一定的哺乳动物细胞毒性。在高浓度（2 mg/ml）情况下能破坏小鼠全部血细胞的细胞膜,而在低浓度（0.08 mg/ml）情况下仅杀死白细胞,对小鼠的红细胞影响不大,但红细胞的形态变得更圆;7、采用膜片钳技术,发现mM级浓度的蝇蛆抗菌肽Muscatoxin能在胰腺β-细胞上形成阳离子通道,而在原生受体和离子通道少的人胚胎肾细胞（HEK293）上不能形成通道。说明Muscatoxin能与β-细胞上特定的受体相互作用后再使细胞膜穿孔形成离子通道,而且这种穿孔效应不依赖于胞外Ca2+的作用;8、采用胞内荧光测钙技术,发现mM级浓度的Muscatoxin使胰腺β-细胞膜穿孔后外钙内流,使得胞内钙浓度升高,这种作用与Muscatoxin的剂量无关,具有累积效应。Muscatoxin的作用浓度降低到fM级后仍有明显的效果,Muscatoxin对细胞膜的穿孔作用很强。9、从黑果蝇的蝇蛆中分离纯化出另一个新抗菌肽SK84,并测出其全部蛋白序列。SK84与Muscatoxin属于同一抗菌肽家族,并与其它种类的果蝇假蛋白有很高的同源性。SK84在1-100μM范围内无溶血活性。SK84对单核白血病（THP-1）、肝癌（HepG2）、乳腺癌（MCF-7）等细胞有抑制作用,但对人胚胎肾细胞（HEK293）、仓鼠卵巢（CHO）细胞无影响。
论文目录:
摘要
Abstract
1 绪论
引言
1.1 抗菌肽的研究
1.1.1 抗菌肽的分类
1.1.2 昆虫抗菌肽的研究进展
1.1.3 抗菌肽的其它生物活性
1.1.4 抗菌肽的作用机制
1.1.5 抗菌肽的结构和功能之间的关系
1.1.6 抗菌肽在天然免疫中的作用
1.1.7 抗菌肽的分子生物学研究
1.1.8 抗菌肽的分离纯化和制备
1.1.9 抗菌肽的应用及展望
1.2 蝇类抗菌肽的研究状况
1.2.1 蝇类资源的开发利用
1.2.2 蝇类抗菌肽的研究状况
1.2.3 家蝇抗菌肽的研究状况
1.3 多肽、蛋白质的研究技术及其发展
1.3.1 蛋白质的分离纯化
1.3.2 蛋白质的纯度鉴定
1.3.3 蛋白质的序列鉴定
1.4 本文研究内容
2 蝇蛆抗菌肽的分离纯化和鉴定
2.1 材料和方法
2.1.1 供试蝇蛆
2.1.2 测试菌株
2.1.3 主要试剂
2.1.4 主要仪器
2.1.5 方法
2.2 实验结果与分析
2.2.1 蝇蛆抗菌肽的初步分离及理化性质研究
2.2.2 RP-HPLC分离纯化蝇蛆抗菌肽
2.2.3 电洗脱分离纯化蝇蛆抗菌肽C组分
2.2.4 蝇蛆抗菌肽Muscatoxin性质鉴定
2.2.5 酸性蝇蛆抗菌肽的电洗脱回收及鉴定
2.3 讨论
2.4 本章小结
3 蝇蛆抗菌肽Museatoxin的生物活性研究
3.1 材料和方法
3.1.1 测试菌株，细胞株等材料
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器
3.1.4 方法
3.2 实验结果与分析
3.2.1 Muscatoxin的扫描电镜实验
3.2.2 Muscatoxin电生理实验
3.3 讨论
3.4 本章小结
4 果蝇蛆抗菌肽SK84的分离纯化和活性研究
4.1 材料和方法
4.1.1 蝇蛆培养
4.1.2 肽的分离纯化
4.1.3 肽的蛋白序列鉴定
4.1.4 重组质粒构建
4.1.5 抗菌活性分析
4.1.6 溶血活性分析
4.1.7 细胞增殖活性分析
4.2 实验结果与分析
4.2.1 SK84的分离纯化和蛋白序列测定
4.2.2 SK84的活性分析
4.3 讨论
4.4 本章小结
5 全文总结
5.1 主要研究结果
5.2 本文的特色与创新之处
5.3 有待继续开展的工作
致谢
参考文献
附录1 攻读博士学位期间发表的论文
附录2 蛋白质电泳技术
附录3 常用氨基酸缩写表
附录4 主要缩写词表(按字母顺序排列)
发布时间: 2010-03-26
参考文献
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