肝脏特异性F蛋白的克隆表达及其多抗制备

论文摘要

肝脏疾病严重影响人类健康，并对社会经济发展产生巨大影响。肝癌是世界上死亡率最高的恶性肿瘤之一，病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬化等都是肝癌主要的致病原。因此肝病的诊断就成为医学诊断学的重要组成部分。人类肝脏F蛋白是一种新型的尚未应用于临床的直接反映肝损伤程度的生物学标志之一。从80年代开始，人们开始研究血清F蛋白含量与肝损伤程度的关系，获得了一些临床数据。肝细胞中的F蛋白浓度与血清F蛋白的浓度之间存在的巨大差异以及F蛋白的严格的组织特异性，使其成为一种非常有希望的反映肝细胞损伤程度的灵敏和特异的指标。目前，肝脏特异性F蛋白的研究与临床应用受到越来越多的关注。本文在前人研究的工作基础上，从新鲜人肝脏组织提取肝脏总mRNA，确定其纯度和完整性后对其进行反转录（RT-PCR）和PCR，扩增出目的基因，然后将其与pUCm-T载体进行连接获得克隆质粒pUCm-T-F并转化到大肠杆菌DH5α中；将测序结果正确的克隆片断与表达载体pET-15b连接，获得F蛋白的表达质粒pET15b-F并将其转化到表达菌株BL21（DE3）pLysS中，用IPTG诱导其表达，表达后通过亲和层析柱(Ni2+-charged IDA His-bind column)纯化，用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳与免疫印迹（Western blot）对其进行检测。以此蛋白为抗原免疫兔子制备兔抗人F蛋白多克隆抗体，用间接ELISA法测定其抗体的效价，用免疫印迹检测其特异性。人F蛋白的基因克隆结果显示目的基因大小为1200bp左右，与预期值相符。表达后的全菌蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，目的条带分子量大小约为43kD，与文献报导一致。Western-blot显示纯化后的F蛋白与豚鼠抗人提纯F蛋白多克隆抗血清反应为阳性，说明我们经基因工程方法得到的纯化的F蛋白具有免疫活性。间接ELISA法测定抗体的效价，结果显示其效价可达1：6400，可用于免疫反应；Western-blot显示制备的抗体与提纯的人肝脏特异性F蛋白发生了反应，表明我们制备的抗体具有免疫特异性，可用于后续的实验研究。肝脏特异性F蛋白是反映肝损伤的一种灵敏、有效而又稳定的指标，同时F抗原在肝病早期诊断与治疗、药物的筛选与疗效观察、治愈状况、肝损伤程度的判断等方面以及法医学方面、免疫耐受肝移植抗排斥方面的研究都具有重要的应用价值。用化学提纯的方法很难得到大量F抗原，这就阻碍了其他研究的进行。因此，本文采用基因工程方法得到人肝脏F抗原的基因克隆，并诱导表达人肝脏F蛋白，解决了其来源问题。同时以此基因工程蛋白为抗原制备多克隆抗体，并通过免疫印迹法证实了此抗体的特异性，为下一步的免疫试剂最适条件的摸索、免疫耐受及其免疫学特性等研究打下基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1. 肝脏特异性 F蛋白的研究背景
• 2. F 蛋白的临床应用
• 3. 临床免疫测定技术
• 4. 选题意义
• 第二章 材料和方法
• 1. 材料
• 2. 主要仪器、试剂和溶液配制
• 3. 人肝脏 F蛋白基因的获得
• 4. 克隆载体的构建
• 5. 表达载体的构建
• 6. 目的蛋白的表达和纯化
• 7 表达蛋白的鉴定
• 8. 抗体制备
• 第三章 结果
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 论文及科研情况
• 附录
• 致谢