创伤弧菌胶体金免疫层析试纸条研制

论文摘要

研究背景和目的创伤弧菌（Vibrio vulnificus, Vv）是弧菌属第5群细菌,革兰氏阴性,弯曲有荚膜的弧菌,主要生长在海水鱼类及贝母类。根据其生化特性、流行病学模式以及宿主范围将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个亚型,其中Ⅰ型Vv是导致人群创伤感染及原发性败血症的病原体。创伤弧菌感染一旦出现败血症,其病死率高达50%以上。原发性创伤弧菌感染发病率呈逐年递增的趋势。国内1990年首次报道一例,随后沿海各地区每年都有散发病例报道,其病死率一直居高不下。对本病的认识不足,发病早期未能正确诊断,或误诊为超敏反应而使用大剂量激素,是造成高病死率的主要原因。在对创伤弧菌感染的诊断方面,由于创伤弧菌引起的腹泻及最初的症状并无特异性,因而实验室诊断成为最可靠的确诊手段。目前细菌性食物中毒（包括创伤弧菌引起的食物中毒）的检验仍以传统培养法为主,但该方法操作繁琐,费时费力,一般要经过：①增菌；②选择性增菌；③选择性平板分离；④生化鉴定；⑤血清学鉴定。耗时较长,往往需要4天～7天甚至更长时间才能作出最终鉴定,且阳性率低,容易造成漏检。而创伤弧菌感染具有起病急、迅速致死的特点,有临床资料表明,住院到死亡时间平均为2天。因此迫切需要建立一种准确而又迅速的诊断方法。目前已建立了不少创伤弧菌检测技术,包括常规及复合PCR、核酸杂交、生物传感器以及利用单克隆抗体建立的ELISA、乳胶凝集试验等技术方法。Parker等建立了以创伤弧菌特异性抗体为基础的酶免疫法,最低检出量为2000个菌／孔,但操作繁琐,条件要求较多,一般需要3-5 h才能完成检测。PCR检测方法的灵敏度高,文献报道以创伤弧菌毒力相关基因vcg为目标序列,设计环介导等温扩增法检测环境中的创伤弧菌,灵敏度可达2.5×103 CFU/ml,且具有良好的特异性,但该方法对实验室要求较高,不适合现场检查所需。能否建立一种快速方便的检测方法,及时准确地对创伤弧菌污染及感染进行分析,为食品安全及临床诊断提供有效证据呢?能否用试纸条对创伤弧菌进行快速检测呢?国内外尚未见相应方法报道,为此我们进行了研究,目的是建立一种适合于创伤弧菌简便、快速、结果易于判断的检测方法。方法：1.创伤弧菌多克隆抗体的纯化及鉴定（1）创伤弧菌标准株ATCC27562,购自中国科学院微生物研究所普通微生物保藏中心。复苏培养后,进行革兰氏染色,油镜观察,划线接种于Marie Broth2216琼脂平板,观察其菌落形态。平板培养获得获得细菌,并进行活菌计数,计算出细菌浓度,并通过甲醛固定法制备创伤弧菌菌体抗原。（2）以创伤弧菌全菌抗原多次免疫新西兰大白兔,制备兔抗创伤弧菌多克隆抗体。采用辛酸-饱和硫酸铵法对多克隆抗血清进行纯化；BCA法检测纯化后抗体蛋白浓度；SDS-PAGE法检测抗体蛋白的纯度,与纯化前蛋白条带的变化进行比较；PMSF法制备创伤弧菌外膜蛋白,Western-Blotting法检测抗体蛋白与细菌外膜蛋白免疫反应结果,观察抗体蛋白的活性；间接ELISA法检测纯化前后抗体蛋白的效价的变化。2.胶体金抗体探针的合成（1）根据试纸条的侧向流动和胶体金的示踪功能,结合免疫学方法,建立创伤弧菌免疫层析试纸条。首先制备不同粒径的胶体金颗粒,采用柠檬酸三钠还原法,利用不同体积的还原剂制备五种不同粒径的胶体金颗粒,紫外-可见光分光光度仪对上述胶体金进行400nm～700nm的光谱扫描,获得最大的吸收波长、吸光值以及中位峰宽,并通过最大吸收峰波长计算出胶体金颗粒粒径的大小。观察不同粒径胶体金的颜色,透明性及稳定性,选择合适的胶体金颗粒进行实验。（2）利用不同体积的K2C03溶液调节胶体金溶液的pH值,偶联抗体蛋白,检测520nm和580nm吸光度A比值,即A520nm/A580nm比值,绘出K2CO3体积-吸光度变化曲线,确定最适K2C03的体积；以K2C03调节pH后的胶体金溶液,偶联不同体积的抗体蛋白,检测A520nm/A580nm比值,绘出蛋白抗体体积-吸光度变化曲线,确定最适抗体蛋白所需量。（3）对金标抗体溶液稳定剂及缓冲液进行优化比较,选择能有效保持金标溶液稳定性及活性的条件。3.创伤弧菌快速检测试纸条研制（1）将纯化的兔抗创伤弧菌多克隆抗体和羊抗兔IgG分别包被在硝酸纤维素膜检测线和质控线上,并经封闭液处理,干燥。玻璃纤维素膜浸泡于胶体金-抗体复合物后,选择适合的干燥条件。将吸水纸,硝酸纤维素膜,金标垫以及样品垫依次粘贴至胶板上,组装裁剪成试纸条。对创伤弧菌胶体金免疫层析试纸条的各项指标进行优化,通过对创伤弧菌检测试验结果的观察及LeicaQ500MC图像分析系统定量分析比较,确定制备试纸条最佳条件。（2）将试纸条插入样品悬液中,待样品层析完毕后观察检测结果。检测线及质控线处各出现一条红线,则表示待检样品中有创伤弧菌,判为阳性；若仅在质控线处出现一条红线,则判为阴性；若质控线不出现红线,则表示测试失效。根据试纸条检测结果对本试纸条的灵敏度、特异性及稳定性进行检测分析。（3）建立ELISA以及试纸条检测方法的标准曲线,进行实际样品中创伤弧菌添加回收试验。（4）利用常规培养及生化鉴定方法从水产品中分离弧菌菌株,并进行试纸条检测试验。结果创伤弧菌1.1758株在mariebroth2216琼脂平板上为黄白色粘液半透明菌落,染色后观察,革兰氏染色阴性,弯曲,杆状,多形性。1.创伤弧菌多克隆抗体的纯化及鉴定创伤弧菌免疫新西兰大白兔,获得兔抗创伤弧菌多克隆抗体血清。以辛酸-饱和硫酸铵法纯化抗体血清,根据标准蛋白浓度及其相应的吸光度值,得到标准曲线,根据所测得的稀释样品的吸光度值,计算出相应的蛋白样品浓度为12.5mg/ml。经SDS-PAGE电泳分析验证在凝胶55kDa-61kDa之间出现蛋白条带,纯度较高。Western-Blotting检测,抗体蛋白能有效地与创伤弧菌外膜蛋白有效结合。经间接ELISA检测,纯化后抗体蛋白效价为1：12800。2.胶体金抗体探针的合成以柠檬酸三钠还原法获得五种不同粒径大小的胶体金颗粒,分别为54.88nm、36.15nm、36.15nm、17.42nm、12.74nm,通过比较观察不同粒径胶体金的颜色,透明性,稳定性及标记难易程度,金标抗体活性质量,选择最大吸收峰波长为520nm,粒径大小为12.7nm的胶体金颗粒进标记实验。通过吸光度A520nm/A580nm曲线比较试验,确定制备胶体金抗体最优体系为：每1ml胶体金加入9μl 0.1mol/L K2CO3及36μg的抗体蛋白。通过离心法纯化胶体金抗体,选择pH 8.2 O.Olmol/L硼酸（0.5%BSA,0.5%PEG20 000,15%蔗糖,0.05%Tween-20）作为金标抗体缓冲液。3.快速检测创伤弧菌的胶体金免疫层析法的建立（1）通过对试纸条检测体系的优化,通过定量分析,确定硝酸纤维素膜检测线最佳包被抗体稀释度为1：4,而质控线为1：8；以1%牛血清白蛋白封闭1h,37。C（1h）烘干；浸泡有胶体金-抗体结合物的金标垫,4。C抽干方法干燥；0.01mol/l pH8.2硼酸,0.5%BSA,0.1%Tween-20,10%蔗糖处理样品垫；硝酸纤维素膜,金标垫,样品垫及吸收纸组装结合成试纸条。（2）构建创伤弧菌胶体金免疫检测试纸条,其检测的灵敏度为2×106CFU/ml;特异性实验显示本试纸条与溶血性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动菌、肺炎克雷氏菌、嗜麦菌窄食单胞菌、产气杆菌、阴沟肠杆菌、奇异变形菌、大肠埃希菌、痢疾杆菌、副溶血弧菌共12株菌均无交叉反应；稳定性检测表明该试纸条可4℃保存4个月；本试纸条回收率为70.68%-106.87%。（3）通过生化鉴定方法获得8株非创伤弧菌菌株,试纸条检测结果与生化鉴定结果一致,未出现假阳性。结论：本研究成功研制出创伤弧菌免疫层析试纸条。本试纸条插入溶液后,20min-30min内可观察结果。本试纸条的检测灵敏度为2×106 CFU/ml;与溶血性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动菌、肺炎克雷氏菌、嗜麦菌窄食单胞菌、产气杆菌、阴沟肠杆菌、奇异变形菌、大肠埃希菌、痢疾杆菌、副溶血弧菌共12株菌均无交叉反应；稳定性检测表明该试纸条可4℃保存4个月。本试纸条可望在临床检验、食品卫生检验、野外环境检验（如野外作业）及创口检验中应用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1 创伤弧菌
• 2 胶体金免疫技术
• 参考文献
• 第一章 创伤弧菌多克隆抗体的纯化及鉴定
• 一、材料和方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 参考文献
• 第二章 胶体金-抗体复合物探针的合成
• 一、材料和方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 参考文献
• 第三章 创伤弧菌快速检测试纸条研制
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 参考文献
• 第四章 创伤弧菌检测试纸条在水产品检测中的初步应用
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 附录
• 论文统计学审稿证明
• 致谢
• 硕士期间论文发表及会议论文情况