论文摘要
研究背景和研究目的脊椎动物中枢神经系统发育是一个极其复杂的生物学过程,涉及到神经细胞增殖、细胞命运的决定、细胞迁移和突触发生。近年来,关于神经细胞增殖,分化和凋亡的研究已成为研究热点。但是,神经细胞存活与凋亡的确切调控机理还没有得到很好的阐明,仍有待于进一步探讨。磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C（PC-PLC）是在各种细胞中普遍存在的一种重要的酶,能特异性水解磷脂酰胆碱产生二酯酰甘油（DAG）和磷酸胆碱（PC）。DAG作为细胞内重要的第二信使,可以激活蛋白激酶C,进一步把信号传递给丝裂原活化的蛋白激酶,引起细胞增殖、分化和凋亡等多方面功能的改变。研究表明,在不同的生理和病理条件下,PC-PLC介导的信号传导通路对多种细胞具有重要的调节作用。本实验室已研究发现PC-PLC参与调节人脐静脉血管内皮细胞和人骨髓间充质细胞的增殖、凋亡与分化过程。另有研究表明,PC-PLC参与调节由氧化谷氨酸盐毒性引起的氧化应激诱导的神经细胞死亡。但是,在正常的生理条件下,PC-PLC对小鼠神经元存活的调节作用目前还不清楚。膜整连蛋白是一大类异源二聚体受体家族,由α和β亚基组成,在哺乳动物发育中的细胞间相互作用,细胞动力学和信号转导方面都具有重要作用。近几年来的研究表明,膜整连蛋白在神经细胞中普遍表达,参与调节神经发育的多个阶段。与其他β亚基不同,膜整连蛋白β4具有特殊的巨胞浆区,此胞浆区由一千多个氨基酸分子组成,能够与细胞骨架和信号分子相连。关于膜整连蛋白β4在细胞信号转导中的作用已成为近年来的研究热点。在外周神经系统的施旺细胞中,膜整连蛋白β4参与调节髓鞘形成的起始阶段,但是在少突胶质细胞中却检测不到膜整连蛋白β4的表达。越来越多的研究表明,膜整连蛋白β4具有细胞特异性的生物学功能。然而,中枢神经系统发育过程中膜整连蛋白β4在神经元存活和凋亡中的功能目前尚未见报道。PC-PLC和膜整连蛋白β4在调节神经元存活和凋亡中有何作用?与PC-PLC和膜整连蛋白β4关联的一些重要的信号分子,如活性氧（ROS）、NADPH氧化酶、及视网膜母细胞瘤基因（Rb）,是否参与此过程?这些问题目前均尚未搞清。据上述背景,本论文旨在探讨PC-PLC和膜整连蛋白β4调节神经元存活与凋亡的作用及其作用机理,为阐明发育过程中神经细胞存活和凋亡的调控机制提供实验证据,同时为临床上治疗神经系统疾病奠定理论基础。研究内容1.小鼠神经元细胞的分离、原代培养及鉴定。2.利用PC-PLC的特异性抑制剂D609研究PC-PLC调节神经元存活的作用。3.研究PC-PLC介导的神经元存活中相关的重要分子及作用机理。4.利用RNAi技术阻断膜整连蛋白β4表达,研究其调节神经元存活与凋亡的作用。5.研究膜整连蛋白β4介导神经元存活与凋亡中相关的重要分子及作用机理。研究方法1.小鼠神经元分离、培养及鉴定:1)神经元的分离和培养,参考Sunanda的方法[Sunanda et al,1998]。2)免疫细胞化学法检测神经元标记物。2.细胞存活率检测:1)用MTT方法,检测细胞存活率。2)用台盼蓝染色,检测细胞存活率。3.细胞凋亡及坏死检测:1)用倒置相差显微镜观察细胞形态变化。2)吖啶橙染色结合激光扫描共聚焦显微镜观察,检测细胞核片断化。3)使用TUNEL染色方法,检测细胞凋亡率。4)通过分析LDH（乳酸脱氢酶）活性,检测细胞是否出现坏死。4.PC-PLC活性检测:参考吴兴中等研究者的方法[Wu et al,1997]。5.用RNAi技术干扰蛋白表达:利用化学合成的siRNA特异性阻断神经元中膜整连蛋白β4的表达。6.ROS检测:利用荧光探针（DCHF）结合激光扫描共聚焦显微术检测其变化。7.SOD活性检测:利用SOD检测试剂盒分析其活性变化。8.NADPH氧化酶活性检测:参考Li的方法[Li et al,2002]。9.细胞内蛋白水平及分布检测:1)用免疫细胞化学法结合激光扫描共聚焦显微术,检测Rb、膜整连蛋白β4的蛋白表达及分布。2)用Western blot方法,进一步检测膜整连蛋白β4的表达。研究结果:1.成功分离、培养小鼠原代神经元选用E14胎鼠大脑组织为实验材料,分离得到原代神经元。通过倒置相差显微镜观察,细胞呈典型的神经元形态,并可形成神经网络连接（图1-1-1）。利用免疫细胞荧光染色,分别检测了NSE和GFAP的表达情况,绝大多数细胞NSE表达呈阳性,统计学分析显示98%的细胞为神经元（图1-1-2）。2.D609抑制神经元的存活2.1 MTT法检测结果表明,2-8μg/ml的D609处理原代神经元8h后,细胞存活率明显下降,为68.78%-20.46%,且下降呈剂量依赖性（表1-2-1）。2.2倒置相差显微镜观察显示,8μg/ml的D609处理神经元8h后,神经元出现明显的凋亡形态,胞体皱缩,胞浆内空泡明显,核固缩,折光性减弱,神经突起发生断裂或明显缩短,凋亡小体形成（图1-2-1）。2.3吖啶橙染色激光扫描共聚焦显微镜观察显示,8μg/ml的D609处理神经元8h后,细胞呈现出典型的凋亡形态学特征,细胞核固缩、染色质凝集且边缘化明显、核碎裂,凋亡小体清晰可见（图1-2-2）。3.PC-PLC调节神经元存活的分子机制3.1对细胞中PC-PLC活性进行检测,发现原代培养的神经元细胞中存在两种类型的PC-PLC,钙离子依赖型PC-PLC和钙离子非依赖型PC-PLC。用8μg/ml的D609处理神经元8h后,两种类型的PC-PLC的酶活显著降低（p＜0.01,图1-3-1）。3.2免疫细胞化学检测结果表明,用8μg/ml的D609处理细胞6h后,膜整连蛋白β4表达明显升高（p＜0.05,图1-3-2）;同时,Rb蛋白的表达水平亦明显高于对照组（p＜0.05,图1-3-3）。3.3利用荧光探针DCHF检测细胞内ROS水平变化的结果表明,用8μg/ml的D609处理细胞6h后,神经元存活被抑制,细胞内的ROS水平显著降低（p＜0.01,图1-3-4）。4.RNAi阻断神经元中膜整连蛋白β4的表达4.1利用免疫组织化学染色结合激光扫描共聚焦显微技术,检测了小鼠大脑皮层冰冻切片和原代神经元中膜整连蛋白β4的表达情况。在胚龄14天（E14）,发育中的大脑皮层和神经元均可以检测到明显的膜整连蛋白β4表达阳性（图2-1-1）。4.2利用罗丹明标记的没有干扰效果的siRNA（rhodamine red-labeled siRNA）转染原代神经元,检测神经元转染效率为30%-50%,说明由siRNA介导的基因沉默实验系统有效可行（图2-1-2）。4.3用膜整连蛋白β4特异性的siRNA阻断其在神经元的表达,随后用免疫细胞化学法和Western blot法（图2-1-5）检测干扰效果,结果表明,此特异性siRNA能够有效的阻断膜整连蛋白β4的表达,且呈剂量（图2-1-3）和时间（图2-1-4）依赖性。5.阻断膜整连蛋白β4表达诱导神经元细胞凋亡5.1 MTT法和台盼蓝染色检测结果表明,用20-60nM的膜整连蛋白β4特异性siRNA转染细胞24-72h后,细胞存活率从95.3%显著下调到13.9%,且呈时间和剂量依赖性,对照siRNA对细胞的存活率没有影响（图2-2-1）。5.2倒置相差显微镜观察和吖啶橙染色结果表明,用膜整连蛋白β4 siRNA转染48小时后,胞体皱缩,出现明显的凋亡形态,折光性减弱,神经突起发生断裂或明显缩短,细胞核固缩、染色质凝集且边缘化、核碎裂,凋亡小体清晰可见（图2-2-2）。5.3用TUNEL法进一步检测了神经元的凋亡率,用siRNA阻断膜整连蛋白β4表达后,标记的阳性细胞高达85.5%（p＜0.01,图2-2-3）,而转染对照siRNA的细胞仅有6.8%被标记。5.4通过分析乳酸脱氢酶（LDH）的活性,发现膜整连蛋白β4的siRNA转染细胞48小时后,各组细胞培养液上清中乳酸脱氢酶的活性没有明显差异,说明细胞没有发生坏死（图2-2-4）。6.膜整连蛋白β4调节神经元存活与凋亡的分子机制6.1利用荧光探针DCHF检测细胞内ROS水平变化,结果表明,用siRNA特异性阻断神经元中膜整连蛋白β4表达,细胞发生凋亡,同时细胞内的ROS水平比正常组或对照组有明显上升（p＜0.01,图2-3-1）。6.2 NADPH氧化酶的活性检测结果表明,膜整连蛋白β4表达下调后,细胞内NADPH氧化酶的活性明显升高（p＜0.01,图2-3-3）;SOD的活性检测结果表明,Cu/ZnSOD和MnSOD的活性均没有明显的变化（p＞0.05,图2-3-2）。6.3在干扰膜整连蛋白β4表达的同时,用NADPH氧化酶的特异性抑制剂（DPI）抑制其活性,神经元的凋亡被有效抑制（p＜0.01,图2-3-4）,同时神经元细胞内活性氧水平的升高被抑制（p＜0.01,图2-3-5）。结论:1.在正常生理条件下,PC-PLC是调节神经元存活的关键因子。2.抑制PC-PLC活性会阻断神经元存活,膜整连蛋白β4和Rb蛋白可能参与PC-PLC介导的神经元存活过程。3.细胞内活性氧的适中水平对于神经元的存活必不可少。4.膜整连蛋白β4是调节神经元存活与凋亡的关键因子。5.NADPH氧化酶产生的活性氧是膜整连蛋白β4调节神经元存活与凋亡的关键因素。6.膜整连蛋白β4的适当表达对神经元的存活具有重要作用。属性不符
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