论文摘要
对FCV CH-GD株进行了全基因的克隆和测序。该病毒具有典型的杯状病毒结构,其基因组为单股正链含polyA的RNA。全长7756 bp,编码3个开放读码框（ORFs）。本研究采用RT-PCR的方法获得了FCV CH-GD株全基因组cDNA。采用PCR方法在FCV 5′端引入锤头状核酶（Hammerhead ribozyme）cDNA序列后,将病毒全长cDNA片段克隆到表达质粒pcDNA-HdvRz中,获得重组质粒pFCV-HdvRz。将重组质粒pFCV-HdvRz转染F81细胞,成功构建了FCV的感染性克隆。通过细胞病变、间接免疫荧光反应、RT-PCR等方法鉴定了拯救的病毒。结果显示:（1）可以观察到细胞病变,其病毒滴度与原毒相比无差异;（2）在间接免疫荧光试验中,可以在细胞质中观察到特异性的荧光,而阴性血清对照组不能观察到荧光。（3）对细胞培养物提取总RNA,进行RT-PCR扩增、测序,能够获得目的片段。在此基础之上,将绿色荧光蛋白基因插入到FCV衣壳蛋白基因后端,并在两端连接处插入FCV 3C样蛋白酶水解位点cDNA序列,构建成表达绿色荧光蛋白的感染性克隆载体。转染F81细胞,观察到了绿色荧光。通过观察绿色荧光来判定GFP在FCV全基因组中的表达情况,从而为表达其它外源基因奠定基础。
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