论文摘要
【目的】研究骨关节炎中细胞凋亡情况,凋亡相关基因、凋亡抑制蛋白及caspase酶系、uPA、uPAR、YKL-40、α2M等在骨关节炎中的表达及意义,从而在一定程度阐明骨关节炎的发病机理,为骨关节炎的治疗和预防提供新的思路。【方法】分别通过制作骨关节炎动物模型取得软骨及滑膜标本和临床获取骨关节炎病人软骨标本,免疫组化S-P法检测凋亡相关基因、凋亡抑制蛋白及caspase酶系、uPA、uPAR、YKL-40、α2M在骨性关节炎软骨及滑膜细胞中的表达情况,TUNEL法检测骨性关节炎软骨及滑膜细胞凋亡情况,并探讨凋亡相关基因、凋亡抑制蛋白及caspase酶系、uPA、uPAR、YKL-40、α2M的表达与软骨、滑膜细胞凋亡程度之间的相关性。一、制作骨关节炎动物模型新西兰大白兔30只,雌雄不限,体重2.0-3.1kg,平均体重2.5kg,左后肢膝关节伸直位石膏管型固定,任意取4只分别于制动后1、2、4、6周取关节软骨及滑膜检测,观察大体标本及软骨、滑膜病理改变情况,了解制动效果。其余26只6周后取左侧膝关节软骨及滑膜标本为实验组,对侧肢体膝关节软骨及滑膜标本为对照组。新鲜标本以10%中性福尔马林液固定48小时,关节软骨10%EDTA脱钙6-7周,常规脱水,石蜡包埋,连续切片,厚4-5μm。采用常规HE染色观察软骨及滑膜病理改变,TUNEL法检测骨性关节炎软骨及滑膜细胞凋亡情况。二、凋亡相关基因在骨关节炎中的表达新鲜标本以10%中性福尔马林液固定48小时,关节软骨10%EDTA脱钙6-7周,常规脱水,石蜡包埋,连续切片,厚4-5μm。采用常规HE染色观察软骨及滑膜病理改变,免疫组化S-P法检测FAS、BAX、BAK、BCL-XL在骨性关节炎软骨及滑膜细胞中的表达情况,TUNEL法检测骨性关节炎软骨及滑膜细胞凋亡情况,并探讨凋亡相关基因的表达与软骨、滑膜细胞凋亡程度之间的相关性。三、尿激酶型纤溶酶原激活物及其受体的表达新鲜标本以10%中性福尔马林液固定48小时,关节软骨10%EDTA脱钙6-7周,常规脱水,石蜡包埋,连续切片,厚4-5μm。采用免疫组化S-P法检测uPA/uPAR的表达,TUNEL法检测骨性关节炎软骨细胞凋亡情况,并研究两者之间的相关性。四、α-2巨球蛋白的表达新鲜标本以10%中性福尔马林液固定48小时,关节软骨10%EDTA脱钙6-7周,常规脱水,石蜡包埋,连续切片,厚4-5μm。采用免疫组化S-P法检测α2M的表达,TUNEL法检测骨性关节炎软骨细胞凋亡情况,并研究两者之间的相关性。五、easpase酶系在骨关节炎中的表达22例骨关节炎患者中男性8例,女性14例;年龄27~72岁,平均年龄51.8岁;病变部位:膝关节9例,髋关节13例。对照组选择骨折关节置换、外伤截肢患者24例。新鲜标本以10%中性福尔马林液固定48小时,关节软骨10%EDTA脱钙6-7周,常规脱水,石蜡包埋,连续切片,厚4-5μm。采用免疫组化S-P法检测caspase酶系的表达,TUNEL法检测骨性关节炎软骨细胞凋亡情况,并研究两者之间的相关性。六、凋亡抑制蛋白的表达22例骨关节炎患者中男性8例,女性14例;年龄27~72岁,平均年龄51.8岁;病变部位:膝关节9例,髋关节13例。对照组选择骨折关节置换、外伤截肢患者24例。新鲜标本以10%中性福尔马林液固定48小时,关节软骨10%EDTA脱钙6-7周,常规脱水,石蜡包埋,连续切片,厚4-5μm。采用免疫组化S-P法检测XIAP的表达,TUNEL法检测骨性关节炎软骨细胞凋亡情况,并研究两者之间的相关性。七、YKL-40的表达22例骨关节炎患者中男性8例,女性14例;年龄27~72岁,平均年龄51.8岁;病变部位:膝关节9例,髋关节13例。对照组选择骨折关节置换、外伤截肢患者24例。新鲜标本以10%中性福尔马林液固定48小时,关节软骨10%EDTA脱钙6-7周,常规脱水,石蜡包埋,连续切片,厚4-5μm。采用免疫组化S-P法检测YKL-40的表达,TUNEL法检测骨性关节炎软骨细胞凋亡情况,并研究两者之间的相关性。【结果】1.动物模型制动后1周即有软骨细胞凋亡的发生,2周后凋亡呈进展趋势,4周时出现大量中层和表层软骨细胞凋亡,6周软骨细胞凋亡进一步增多,此时,大体标本见关节软骨灰黄色,出现溃疡,HE染色切片下可见软骨细胞数目减少,软骨基质“微纤化”,软骨细胞出现空泡状改变,呈现典型的OA病理特征。实验组关节软骨细胞凋亡指数(AI)为((?)±S)6.708±4.278,对照组关节软骨细胞凋亡指数为((?)±S)1.583±1.613,两组的差异具有显著性(t=5.491,P<0.01);实验组关节滑膜中的细胞凋亡指数为2.667+2.036,对照组关节滑膜中的细胞凋亡指数为2.917±2.185,两组的差异不具有显著性(t=-0.410,P>0.05)。2.凋亡相关基因在软骨细胞中fas蛋白表达实验组阳性率高于对照组,差异具有显著性(P<0.05),在滑膜细胞中则差异没有显著性(P>0.05);在关节软骨细胞中bcl-xl蛋白的表达实验组阳性率低于对照组,但差异没有显著性(P>0.05);在滑膜细胞中的表达实验组阳性率高于对照组,差异具有显著性(P<0.01);在关节软骨细胞中bax蛋白的表达实验组阳性率高于对照组,差异具有显著性(P<0.01);在滑膜细胞中的表达实验组阳性率低于对照组,但差异没有显著性(P>0.05);在关节软骨细胞中bak蛋白的表达实验组阳性率高于对照组,差异具有显著性(P<0.05);在滑膜细胞中的表达实验组阳性率高于对照组,但差异没有显著性(P>0.05);实验组关节软骨中软骨细胞凋亡程度与fas蛋白的表达呈正相关,差异具有显著性(P<0.01),在滑膜中滑膜细胞凋亡程度与fas蛋白的表达没有明显的相关性(P>0.05);实验组关节软骨中软骨细胞凋亡程度与bcl-xl蛋白的表达呈负相关,差异具有显著性(P<0.05),在滑膜中滑膜细胞凋亡程度与bcl-xl蛋白的表达没有明显的相关性(P>0.05);实验组关节软骨中软骨细胞凋亡程度与bax及bak蛋白的表达呈正相关,差异具有显著性(rs=0.642,rs=0.655,P<0.01),且连续切片观察发现,在bax及bak蛋白表达阳性的区域内常有TUNEL反应阳性分布;在滑膜中滑膜细胞凋亡程度与bax及bak蛋白的表达没有明显的相关性(rs=-0.190,rs=0.347,P>0.05)。3.尿激酶型纤溶酶原激活物及其受体uPA在实验组阳性率高于对照侧,差异具有显著性(X2=4.09,P<0.05):uPAR在实验组阳性率高于对照组,差异具有显著性(X2=5.689,P<0.05):实验组关节软骨中软骨细胞凋亡程度与软骨中uPA/uPAR的表达呈正相关,差异具有显著性(rs=0.528,P<0.01/rs=0.655,P<0.01)。4.α-2巨球蛋白α2M在实验组阳性率高于对照侧,差异具有显著性(X2=4.09,P<0.05);α2M阳性染色主要在软骨表层,深层则较少见到;实验组关节软骨中软骨细胞凋亡程度与α2M表达呈负相关,差异具有显著性(rs=-0.488,P<0.05)。5.Caspase酶系caspase-3在实验组的软骨细胞阳性率高于对照组,差异具有显著性(P<0.01);caspase-6在实验组的软骨细胞阳性率高于对照组,差异具有显著性(P<0.05);caspase-8在实验组的软骨细胞阳性率高于对照组,差异具有显著性(P<0.01);实验组关节软骨中软骨细胞凋亡程度与caspase3的表达呈正相关,差异具有显著性(rs=0.481,P<0.05);实验组关节软骨中软骨细胞凋亡程度与caspase6的表达呈正相关,差异具有显著性(rs=0.613,P<0.05);实验组关节软骨中软骨细胞凋亡程度与caspase8的表达呈正相关,差异具有显著性(rs=0.685,P<0.05)。6.凋亡抑制蛋白XIAP在实验组的软骨细胞阳性率高于对照组,但差异没有显著性(X2=0.2635,P>0.05)。实验组关节软骨细胞中,软骨细胞凋亡程度与XIAP的表达呈负相关,XIAP表达阴性的16例中,末端标记技术检测结果有13例为阳性,差异具有显著性(rs=-0.441,P<0.05)。7.YKL-40YKL-40在实验组阳性率高于对照组,差异具有显著性(X2=4.330,P<0.05):实验组关节软骨中软骨细胞凋亡程度与YKL-40的表达呈正相关,差异具有显著性(rs=0.613,P<0.05);【结论】1.采用膝关节伸直位制动5~6周的方法,可制作较好的骨关节炎动物模型。2.在骨关节炎动物模型中,关节软骨细胞的凋亡明显增加,可认为软骨细胞凋亡过盛是关节软骨退变发展成骨关节病的重要原因之一。3.FAS、BAX、BAK、BCL-XL等凋亡相关基因在骨性关节炎软骨及滑膜细胞中的表达异常,细胞凋亡程度与FAS、BAX、BAK、BCL-XL等凋亡相关基因的表达具有相关性,表明FAS、BAX、BAK、BCL-XL等凋亡相关基因与骨关节炎发生发展有密切关系。4.凋亡抑制蛋白及caspase酶系、uPA/uPAR、YKL-40、α2M等在骨关节炎中表达异常,细胞凋亡程度与FAS、BAX、BAK、BCL-XL等凋亡相关基因的表达具有相关性,表明表达其与骨关节炎发生发展有密切关系。
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