论文摘要
第一篇腺病毒载体构建及在EBV阳性鼻咽癌细胞中的靶向表达目的:构建理想的复制缺陷性腺病毒ad5.oriP.HRP,使其在EBV阳性的鼻咽癌细胞C666-1内可以靶向性转染及表达。方法:通过酶切质粒pEIG3获得一个897bp大小的SalⅠ-HindⅢ片断,其中含有EB病毒的家族重复序列（oriP-FR）和基础的CMV IE启动子。然后将酶切片断克隆入穿梭质粒pΔEIsp1A的SalⅠ-HindⅢ位置,制造出pΔEIsp1A/oriP。oriP-CMV启动子含有621bp的EB病毒的复制子,其中含有20个可与EBNA1（Epstein-Barr virus nuclear antigen 1）结合的位点,被克隆在70bp的CMVIE启动子的上游。将BamHI-HindⅢ间含有β-gal、HRP的片断克隆质粒入pΔEIsp1A/oriP的oriP-CMV下游构建成pΔEIsp1A/oriP-β-gal,pΔEIsp1A/oriP-HRP,将重组质粒常规筛选。将回收的pΔEIsp1A/oriP-β-gal或pΔEIsp1A/oriP-HRP片段取1ul补加ECBuffer至150ul,再加入质粒pJM17,处理后与293细胞孵育,置于37℃,5%CO2培养箱培养,6h后换液,37℃培养,5天左右出现病毒空斑。常规鉴定、纯化,病毒滴定。并实验ad5.oriP.HRP,ad5.oriP.gal在C666-1,KS1和CNE-2Z的转染,PCR或Western Blot,检测ad5.oriP.HRP在相关细胞的转染及表达。结果:重组腺病毒ad5oriP.HRP感染的293细胞抽提DNA PCR鉴定在1229bp出现目的条带;ad5oriP.HRP感染EBV阳性C666-1细胞后,PCR扩增产物可见目的条带,而KS1和CNE-2Z未见目的产物。Western Blot分析在C666-1细胞52kD可见目的条带,而对照组未见;和空病毒ad5.null相比重组腺病毒ad5oriP在C666-1细胞内表达效率提高800倍。结论:重组腺病毒ad5oriP.HRP在EBV阳性的C666-1细胞内可高效、靶向性转染和表达。第二篇辣根过氧化物酶/吲哚三醋酸酶前药对鼻咽癌细胞的杀伤作用目的:研究adv5.oriP.HRP对鼻咽癌细胞靶向性转染和HRP/IAA在乏氧和有氧状态下对其杀伤作用;探讨HRP/IAA对裸鼠鼻咽癌模型的体内杀伤作用。方法:将adv5.oriP.HRP感染C666-1,KS1和CNE-2Z细胞,加入IAA,用MTT法评估细胞杀伤效果;建立乏氧有氧条件,检测HRP/IAA在乏氧状态下鼻咽癌细胞的杀伤能力;建立鼻咽癌裸鼠模型,瘤内注射HRP/IAA,计算瘤体的体积大小变化评估其体内治疗效果。结果:adv5.oriP.HRP能靶向性在EBV阳性的鼻咽癌细胞内高效转染和表达;HRP/IAA对鼻咽癌细胞有强大的杀伤作用,在一定范围内杀伤能力随孵育时间和病毒载体及前药的浓度增高而增加;在乏氧状态下,HRP/IAA有同样的杀伤能力;当感染细胞占总细胞的10%左右时,65%的肿瘤细胞死亡,当比例达到20%时,90%以上的细胞死亡。显示HRP/IAA有很强的旁观者效应。瘤内注射adv5.oriP.HRP和IAA可见明显的肿瘤缩小、消失,提示良好的体内抗肿瘤效果。结论:adv5.oriP.HRP能在EBV病毒阳性的细胞内靶向性表达;HRP/IAA在乏氧和有氧状态下均有强大的杀伤能力和旁观者效应并可有效杀伤裸鼠的鼻咽癌细胞而使肿瘤体积缩小和消失。adv5.oriP.HRP/IAA是理想的病毒介导的酶前药基因组合。
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