通过遗传操作提高植物磷素营养利用率的研究

论文摘要

在全球范围内，可耕地面积中70％以上为酸性和碱性土壤，在这类土壤中的磷大部分以植物不能吸收和利用的难溶性磷酸盐的形式存在，因此低磷元素利用率成为限制作物产量的一个主要因素。为了提高磷素的利用率和确保植物的产量，每年大约要施用3千万吨的磷肥，但是由于吸附作用，沉淀作用或转变成有机磷的形态，80％施用的磷肥不能被植物吸收利用。因此，很有必要开展植物磷素利用能力的研究。已有研究表明改变植物体内有机酸代谢的水平，增加有机酸的分泌量是增强植物利用难溶磷酸盐的一种潜在分子机制。此外，增加根部高亲和性磷酸转运蛋白的含量也可以促进植物吸收土壤低浓度磷素营养。本研究通过遗传操作在烟草体内过量表达有机酸代谢途径关键酶柠檬酸合成酶和苹果酸脱氢酶及能够增强根部磷素吸收能力的高亲和性磷酸转运蛋白基因以提高烟草抗铝毒和吸收磷素营养的能力。其主要研究结果如下：1．利用本实验室已经构建成功的以rbcS为启动子的光诱导型柠檬酸合成酶（Citrate synthase，CS）基因的植物表达载体，通过农杆菌转化法获得了转CS基因的烟草植株。CS酶活测定结果表明转CS基因烟草的柠檬酸合成酶的活性是野生型烟草的1-5.5倍。在铝毒的胁迫下，转CS基因烟草能分泌较多的有机酸，根系生长较好，能提高铝毒抗性和对磷素吸收能力。2．从大肠杆菌中克隆出苹果酸脱氢酶（E．coli Malate dehydrogenase，EMDH），并成功构建了以rbcS为启动子的光诱导型MDH植物表达载体。通过农杆菌转化法获得了转MDH基因烟草植株。酶活测定结果表明转MDH基因烟草植株中MDH活性是野生型烟草的1-3.3倍，铝毒处理实验结果表明转MDH基因烟草植株具有较好的根伸长量和苹果酸分泌量。3．从拟南芥中克隆出磷酸载体蛋白（Pi transporter，Pi）基因，并构建了以35S为启动子的组成型Pi基因植物表达载体。通过农杆菌转化法获得转Pi基因烟草植株。在低磷条件下，转Pi基因烟草植株比对照植株生长得好。4．通过农杆菌介导的方法，把以rbcS为启动子的光诱导型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）植物表达载体（本实验室构建）转化到转CS基因烟草植株或转MDH基因烟草植株中，获得了转PEPC和CS双基因烟草植株和转PEPC和MDH双基因烟草植株。转双基因烟草植株的生理生化效果待进行分析。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 第一章 前言
• 1.1 植物磷素营养基因工程概述
• 1.2 植物磷素营养有机酸代谢途径基因工程的研究现状
• 1.3 主要研究内容和目的意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验操作基本方法
• 2.3 农杆菌介导法转化植物
• 2.4 植物组织总蛋白定量测定
• 2.5 转基因植物的酶活测定方法
• 2.6 转基因植物外源基因表达水平分析
• 2.7 转基因植物铝毒抗性检测方法
• 2.8 转基因植物根伸长实验测定
• 2.9 转基因植物有机酸分泌检测方法
• 2.10 检测 CS转化株在酸性基质上的生长实验
• 2.11 检测 PI转化株在低磷基质上的生长状况实验
• 第三章 实验结果
• 3.1 获得能够增强烟草磷素营养吸收的CS基因的烟草转化株
• 3.2 获得具有较好铝毒抗性的EMDH转化株
• 3.3 获得具有较好磷素吸收的PI基因转化株
• 3.4 获得双基因烟草
• 第四章 讨论
• 4.1 烟草 CS基因在烟草中表达及生理效应
• 4.2 大肠杆菌MDH基因在烟草中表达及生理效应
• 4.3 高亲和性拟南芥 PI基因在烟草中的表达及生理效果
• 4.4 农杆菌介导法与抗生素浓度的选择
• 第五章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录 攻读硕士期间发表文章