两种蜘蛛毒素结构与功能研究

论文摘要

敬钊缨毛蛛毒素-Ⅴ（chilobrachys jingzhao,JZTX-Ⅴ）是Kv4.3的一种专一性抑制剂,对表达在HEK293细胞上的野生型Kv4.3的IC5o值为10nmol/L。利用膜片钳检测发现,25 nmol/L JZTX-Ⅴ可以使野生型Kv4.3的稳态激活曲线和稳态失活曲线向去极化方向发生显著性漂移,而且可以显著延缓Kv4.3的激活和失活时间常数,但对失活恢复时间常数没有显著性影响,因此推断JZTX-Ⅴ是钾通道的一种门控调节型毒素。进一步将Kv4.3电压敏感区中S3b—S4上的氨基酸进行丙氨酸扫描,并研究JZTX-Ⅴ与这些突变体的相互作用,发现第282位的缬氨酸和第286位的苯丙氨酸是JZTX-Ⅴ与Kv4.3相互作用的关键残基。此外,通过建立吗啡成瘾小鼠模型,观察了JZTX-Ⅴ对纳洛酮催促戒断症状的治疗作用。结果表明JZTX-Ⅴ在戒断后的15min内能减少小鼠的跳跃次数,而且在1μg/20g和0.1μg/20g, 10μg/20g剂量下,JZTX-Ⅴ能有显著（P<0.05）和极显著（P<0.01）的抑制跳跃次数的作用。根据这些现象和数据,JZTX-Ⅴ有希望成为一种戒毒先导分子。利用阳离子交换色谱和反相高效液相色谱,从广西雷氏大疣蛛（Macrothele raveni）粗毒中分离纯化到一种神经多肽毒素,将其命名为雷氏大疣蛛毒素—Ⅶ（Raventoxin-Ⅶ）。运用MALDI-TOF质谱分析发现,它的精确相对分子质量为3158.155Da。利用Edman降解气相蛋白质测序仪测得其氨基酸序,其中有6个半胱氨酸形成3对二硫键。初步电生理实验表明,Raventoxin-Ⅶ对大鼠背根神经节（DRG）上的河豚毒素敏感型钠通道（TTX-sensitive Na+ channel）电流有抑制作用,其IC50值为12.2μmol/L,但对河豚毒素不敏感型钠通道（TTX-resistant Na+ channel）电流没有作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 1.1 敬钊缨毛蛛多肽神经毒素概述
• 1.1.1 前言
• 1.1.2 敬钊缨毛蛛粗毒采集和分离纯化策略
• 1.1.3 敬钊缨毛蛛多肽类神经毒素
• 1.1.4 敬钊缨毛蛛毒素前体的分析
• 1.2 雷氏大疣蛛粗毒生物学功能概述
• 1.2.1 前言
• 1.2.2 雷氏大疣蛛粗毒采集和分离纯化策略
• 1.2.3 雷氏大疣蛛粗毒的生物学功能
• 1.3 电压门控钾通道及其相互作用毒素概述
• 1.4 展望
• 第二章 JZTX-V对表达在HEK293细胞上的野生型KV4.3的效应以及KV4.3电压敏感区上与其相互作用的关键残基
• 2.1 前言
• 2.2 材料、试剂和仪器
• 2.2.1 毒素与野生型质粒
• 2.2.2 细胞培养
• 2.2.3 试剂
• 2.2.4 仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 Kv4.3钾离子通道S3b—S4胞外连接环突变体的构建
• 2.3.2 质粒提取
• 2.3.3 质粒转染
• 2.3.4 电生理方法
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 Kv4.3钾离子通道S3b—S4胞外连接环突变体的构建
• 2.4.2 JZTX-V与野生型Kv4.3的浓效关系
• 2.4.3 JZTX-V对野生型Kv4.3的抑制具有电压依赖性
• 2.4.4 JZTX-V对野生型Kv4.3激活动力学和失活动力学的影响
• 2.4.5 JZTX-V对野生型Kv4.3失活恢复时间常数的影响
• 2.4.6 野生型Kv4.3上与JZTX-V相互作用的关键残基
• 2.5 讨论
• 第三章 雷氏大疣蛛毒素—Ⅶ的分离纯化与初步电生理活性研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料、试剂和仪器
• 3.2.1 动物与蜘蛛粗毒
• 3.2.2 化学试剂
• 3.2.3 仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 粗毒的分离纯化
• 3.3.2 质谱分析与序列分析
• 3.3.3 半胱氨酸的碘乙酰胺修饰
• 3.3.4 电生理实验
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 Raventoxin-Ⅶ的分离纯化
• 3.4.2 Raventoxin-Ⅶ的分子量和氨基酸序列测定
• 3.4.3 Raventoxin-Ⅶ对大鼠背根神经节（DRG）电压门控钠通道电流的影响
• 3.5 讨论
• 第四章 JZTX-V对吗啡成瘾小鼠戒断症状的影响
• 4.1 前言
• 4.2 材料、试剂与仪器
• 4.2.1 实验动物
• 4.2.2 化学试剂
• 4.2.3 仪器
• 4.3 方法
• 4.3.1 动物分组及给药
• 4.3.2 小鼠吗啡成瘾模型的建立
• 4.3.3 戒断症状的观察
• 4.3.4 统计学处理
• 4.4 实验结果
• 4.5 讨论
• 参考文献
• 附录
• 附录
• 致谢