一株鸡传染性贫血病毒野毒株致病性及其全基因组序列比较

论文摘要

鸡传染性贫血病毒（Chicken anemia virus, CAV）可以破坏造血系统,并可使淋巴器官萎缩,导致鸡群免疫抑制,CAV的免疫抑制又经常使感染鸡群并发或继发其它病原体的多重感染。本文通过对1日龄SPF鸡的攻毒实验系统的研究了CAV野毒株CAV-C14对SPF鸡的致病性。攻毒28天和42天后,CAV-C14能够引起SPF鸡体重下降、免疫器官（胸腺、法氏囊）萎缩以及股骨、胫骨骨髓颜色变淡变黄等临床症状,在攻毒后12天和14天后均可引起循环血中红细胞数一定程度的下降,攻毒14天后红细胞数比对照组显著下降（P<0.05）。但在104TCID50/只的攻毒剂量下没有引起SPF鸡的死亡。用1日龄SPF鸡人工感染C14株CAV和禽网状内皮增生病病毒（REV）,研究了CAV单独以及与REV共感染时对鸡体疫苗免疫反应的影响。在攻毒后21天,CAV单独感染组（ 5.81±1.38）与REV单独感染组（4.56±2.57）的AIV-H9 HI抗体滴度（log2）比对照组（7.43±1.16）显著降低,共感染组（2.8±2.57）的抗体滴度下降更为显著;在攻毒后35天,CAV单独感染组（7.55±1.63）与REV单独感染组（7.31±2.78）AIV-H5 HI抗体滴度（log2）比对照组（9.42±1.57）显著降低,共感染组（4.86±3.08）抗体滴度下降的更为显著。结果表明,在用禽流感病毒（AIV,H5和H9）疫苗免疫后,CAV单独感染组与REV单独感染均能显著抑制鸡体对H5和H9亚型禽流感病毒灭活疫苗的HI抗体反应,在CAV与REV共感染后,这种抑制作用更为明显。在攻毒21天和35天后,C14株CAV单独感染能够抑制鸡体对新城疫病毒（NDV）和传染性法氏囊病病毒（IBDV）疫苗的免疫反应,但与对照组在统计学上的差异不显著。然而,C14株CAV可以显著加重（P<0.05）REV感染对鸡体在免疫NDV和IBDV疫苗后抗体反应的抑制作用。本研究证实了CAV与REV共感染时对SPF鸡在免疫抑制上存在协同作用。用PCR方法分段扩增出CAV-C14基因组的三条部分重叠片段,分别克隆于T载体并进行测序,拼接后得到其全基因组序列。测序结果表明,CAV-C14株基因组全长2298bp,含有三个互相重叠的开放阅读框和一个调控区。将C14与国内外已发表的CAV参考株基因组比较,同源性为97.2%-99.2%。序列比较还表明,CAV非编码区中含有的多个与复制及转录调控相关的基序序列都非常保守。CAV的三个编码基因VP1、VP2和VP3均有一定程度变异,以VP1变异性最大,且不同毒株间的三个蛋白质氨基酸序列的变异是互不相关的。根据已发表的鸡传染性贫血病毒（CAV）的基因序列设计合成一对引物,以山东分离野毒株CAV-C14为模板,扩增了VP1基因内部的一大段序列。将PCR产物按正确的阅读框架克隆到表达性载体pGEX-6P-1谷胱甘肽转移酶（GST）基因的下游。将筛选到的相应重组质粒转化的大肠杆菌BL21株,在1.0mM IPTG浓度和37℃条件下诱导表达。SDS-PAGE电泳后将表达产物回收并免疫小鼠,所得抗血清可在间接免疫荧光试验中与CAV感染的MSB1细胞中呈阳性反应,抗体效价达到26。试验结果表明,在大肠杆菌中表达的VP1蛋白保留了天然蛋白的某些抗原性。而且,由此得到的抗体可作为诊断用的特异性单因子血清

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 鸡传染性贫血病病毒（CAV）研究综述
• 1. 病原学研究
• 1.1 CAV 的发现和命名
• 1.2 CAV 的病毒学分类
• 1.3 CAV 形态学结构和理化特性
• 2. 流行病学研究
• 2.1 发生与分布
• 2.2 自然宿主与实验宿主
• 2.3 传播
• 3. CAV 分子生物学研究
• 3.1 CAV 基因组
• 3.2 病毒DNA 的复制方式
• 3.3 CAV 基因组转录和转录调控因子
• 3.4 CAV 编码的蛋白
• 4. CAV 的致病性
• 5. 诊断方法
• 5.1 根据临床症状做初步诊断
• 5.2 依据病理剖检变化进行诊断
• 5.3 病原学诊断
• 5.4 血清学诊断
• 5.5 分子生物学诊断
• 6.C AV 的预防和防制
• 7. 本研究的目的及意义
• 试验一、CAV 的致病性及其与 REV 共感染 SPF 鸡对疫苗免疫反应的抑制作用
• 1. 材料与方法
• 1.1 病毒
• 50的测定'>1.2 病毒TCID₅₀的测定
• 1.3 CAV-C14 株卵黄囊接种SPF 鸡胚后对孵出SPF 鸡骨髓的观察
• 1.4 CAV-C14 株对SPF 鸡的致病性试验
• 1.5 体重、胸腺和法氏囊重的检测
• 1.6 血清抗体测定
• 1.7 数据统计分析
• 2. 结果
• 2.1 CAV-C14 株卵黄囊接种SPF 鸡胚后对孵出SPF 鸡骨髓的影响
• 2.2 CAV-C14 株感染对SPF 鸡的致病性的临床观察
• 2.3 CAV-C14 株感染对SPF 鸡血液红细胞数的影响
• 2.4 CAV 和REV 感染对SPF 鸡法氏囊和胸腺发育的影响
• 2.5 CAV 和REV 感染对NDV 疫苗免疫后抗体反应的影响
• 2.6 CAV 和REV 感染对AIV H5/H9 疫苗免疫后抗体反应的影响
• 2.7 CAV 和REV 感染对IBDV 疫苗免疫后抗体反应的影响
• 3. 讨论
• 试验二、CAV-C14 株全基因组序列分析与比较
• 1、材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2. 结果
• 2.1 PCR 扩增产物的鉴定
• 2.2 CAV-C14 株全基因组核苷酸序列
• 2.3 CAV-C14 株与其它CAV 参考株全基因组序列比较
• 2.4 CAV-C14 株与其它CAV 参考株基因组VP1、VP2 和VP3 氨基酸序列比较
• 2.5 不同毒株CAV 基因组中非编码区转录调控相关基序比较
• 3. 讨论
• 试验三、鸡传染性贫血病毒（CAV） VP1蛋白基因的原核表达及抗血清的制备
• 1. 材料与方法
• 1.1 分子生物学试剂
• 1.2 SDS-PAGE 电泳相关溶液配制
• 1.3 病毒和菌株来源
• 1.4 病毒DNA 的提取
• 1.5 引物的设计与合成
• 1.6 用PCR 扩增VP1 基因
• 1.7 基因的克隆及鉴定
• 1.8 重组融合蛋白的诱导表达及重组菌菌体裂解物的凝胶电泳
• 1.9 重组菌表达产物抗血清的制备
• 1.10 间接免疫荧光试验（IFA）
• 2. 结果
• 2.1 PCR 扩增结果
• 2.2 重组质粒的酶切鉴定
• 2.3 VP1 蛋白基因序列比较
• 2.4 重组质粒的诱导表达
• 2.5 抗融合蛋白小鼠血清的对 CAV-MSB1 的 IFA 抗体效价
• 3. 讨论
• 研究的主要结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 攻读硕士学位期间发表的主要论文