本氏烟草NbLRK1介导的PTI免疫应答在马铃薯晚疫病抗性中的作用

论文摘要

病原相关分子模式（PAMPs）激发的免疫反应PTI,是植物抵抗绝大部分病原微生物侵染的重要机制,也是植物的基础防御系统,PTI具有广谱持久的特点。研究植物PTI抗性机制对于指导植物广谱持久抗性育种具有重要理论和应用价值。本氏烟草（Nicotiana benthamiana）对晚疫病（Phytophthora infestans）的抗性主要是通过对晚疫病菌分泌的INF1的识别,凝集素类受体激酶NbLRK1是本氏烟草中能够与INF1互作的蛋白,参与INF1引起的HR反应。在马铃薯中目前并没有报道可以识别1NF1的受体或者与INF1互作的蛋白。本研究以本氏烟草NbLRK1-INF 1互作为基础,研究NbLRK-在马铃薯晚疫病抗性PTI免疫应答中的作用,以期为利用PTI提高马铃薯晚疫病抗性奠定基础。主要研究结果如下：1.克隆了本氏烟草类受体激酶NbLRK1基因,经测序分析发现我们克隆的基因编码氨基酸序列与已报道基因编码氨基酸序列存在18个氨基酸的差别,但是主要的激酶子域部分完全相同；酵母双杂（Y2H）及双分子荧光互补（BiFC）实验证实能够与INF1互作。2.应用VIGS技术在本氏烟草中将NbLRK1基因沉默,沉默叶片上瞬时表达1NF1,结果显示INF1引起的HR反应明显延迟,表明NbLRK1参与INF1引起的细胞死亡反应；沉默NbLRK1叶片瞬时表达INF1 24 h后,在接种点H202积累明显下降,预示NbLRK1参与基础防卫反应；并且NbLRK1基因沉默后本氏烟草对晚疫病的抗性降低。3.获得了超量表达NbLRK1的鄂马铃薯3号转基因株系,晚疫病菌接种鉴定显示超量表达株系晚疫病抗性增强；在超量表达株系中瞬时表达INF1和在马铃薯08CA0891材料叶片中共表达NbLRK1/INF1未出现HR反应,表明NbLRK1可以增强马铃薯对晚疫病的抗性,但不能在马铃薯中介导INF1引起的HR反应。4.在马铃薯中克隆了NbLRK1同源基因StLRK1经测序分析发现存在两种类型,一类编码718个氨基酸,另一类编码721个氨基酸,两种类型与本氏烟草NbLRK1氨基酸序列都存在很多差异,但VIb激酶子域没有发生变化。酵母双杂交和BiFC实验证实StLRK1也能够与INF1互作。表达模式分析结果显示,晚疫病菌、SA、JAETH处理后StLRKl明显上调表达,表明该基因受晚疫病菌、SA、JA和ETH的诱导表达。StLRKl基因克隆为研究该基因在晚疫病抗性中的功能奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第一章 前言
• 1.1 马铃薯晚疫病概述
• 1.2 马铃薯晚疫病抗性研究
• 1.2.1 垂直抗性
• 1.2.2 水平抗性
• 1.3 植物抗病免疫应答
• 1.3.1 PTI免疫应答
• 1.3.2 ETI免疫应答
• 1.3.3 PTI和ETI信号途径和下游反应
• 1.4 类受体激酶（RLKs）与植物抗病性
• 1.4.1 RLKs分类
• 1.4.2 RLKs与植物抗病性
• 1.5 植物基因功能研究方法
• 1.5.1 超表达目的基因
• 1.5.2 干涉技术
• 1.5.2.1 RNAi技术
• 1.5.2.2 VIGS技术
• 1.6 基因互作的研究方法
• 1.6.1 酵母双杂交系统（Y2H）
• 1.6.2 分子荧光互补技术（BiFC）
• 1.7 本课题的提出及意义
• 第二章 本氏烟草NbLRK1在晚疫病抗性中的作用
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料、载体、菌株及实验试剂
• 2.1.1.1 植物材料
• 2.1.1.2 载体和菌株
• 2.1.1.3 实验试剂
• 2.1.2 NbLRK1的克隆及与INF1互作验证
• 2.1.2.1 NbLRK1的克隆
• 2.1.2.2 酵母双杂交验NbLRK1与INF1互作
• 2.1.2.3 双分子荧光互补（BiFC）实验验证NbLRKl与INFl互作
• 2.1.3 NbLRK1基因功能鉴定
• 2.1.3.1 在本氏烟草中VIGS沉默NbLRK1及瞬时表达INF1
• 2O₂的积累'>2.1.3.2 DAB染色观察本氏烟草叶片H₂O₂的积累
• 2.1.3.3 沉默NbLRK1本氏烟草晚疫病菌接种抗性鉴定
• 2.1.4 在马铃薯中验NbLRK1晚疫病抗性功能
• 2.1.4.1 超量表达NbLRK1马铃薯转基因株系获得
• 2.1.4.2 转基因株系基因表达量分析
• 2.1.4.3 转基因株系晚疫病菌接种鉴定
• 2.1.4.4 马铃薯叶片瞬时表达INF1及瞬时共表达NbLRK1/INF1
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 NbLRK1克隆
• 2.2.2 本研究克隆的NbLRK1可以和INF1互作
• 2.2.2.1 酵母双杂交证实NbLRK1与INF1互作
• 2.2.2.2 BiFC实验证实NbLRK1与INF1互作
• 2.2.3 NbLRK1基因功能鉴定
• 2.2.3.1 本氏烟草中沉默NbLRK1推迟INF1引起的HR反应
• 2O₂的积累下降'>2.2.3.2 NbLRK1沉默瞬时表达INF1后H₂O₂的积累下降
• 2.2.3.3 NbLRK1沉默后本氏烟草晚疫病菌的抗性下降
• 2.2.3.4 NbLRK1超量表达株系的获得
• 2.2.3.5 超量表达株系晚疫病抗性增强
• 2.2.3.6 马铃薯叶片上瞬时表达NbLRK1/INF1未诱导HR反应
• 第三章 马铃薯StLRK1基因克隆及与INF1互作分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料、载体、菌株及实验试剂
• 3.1.1.1 植物材料
• 3.1.1.2 载体和菌株
• 3.1.1.3 实验试剂
• 3.1.2 StLRK1的克隆
• 3.1.3 StLRK1表达模式分析
• 3.1.3.1 生物及非生物胁迫处理
• 3.1.3.2 StLRK1在不同组织器官中的表达
• 3.1.3.3 qRT-PCR分析StLRK1的表达模式
• 3.1.4 StLRK1与INF1互作研究
• 3.1.4.1 酵母双杂交验证StLRK1与INF1互作
• 3.1.4.2 BiFC实验验证StLRK1与INF1互作
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 StLRK1的克隆
• 3.2.2 StLRK1的表达模式分析
• 3.2.2.1 StLRK1受晚疫病菌诱导表达
• 3.2.2.2 StLRK1对信号分子诱导的响应
• 3.2.2.4 StLRK1在不同组织器官中的表达
• 3.2.3 StLRK1与INF1互作
• 3.2.3.1 酵母双杂交实验证实StLRK1与INF1互作
• 3.2.3.2 BiFC实验证实StLRK1与INF1互作
• 第四章 结论讨论
• 4.1 INF1能够与NbLRK1和StLRK1激酶域互作
• 4.2 NbLRK1参与INF1介导的HR,但不是与INF1识别的关键受体
• 4.3 NbLRKl参与晚疫病抗性基础防卫反应
• 4.4 StLRK1参与马铃薯的抗病免疫应答
• 4.5 研究展望
• 参考文献
• 致谢