砂仁挥发油有效成分包合物胶囊物的制备工艺及其生物利用度研究

论文摘要

研究目的1.采用不同提取方法,分别提取砂仁不同部位的挥发油,采用气相色谱质谱联用（GC-MS）方法对不同部位提取的挥发油成分进行鉴定。2.以标准红毛色癣菌（Trichophyton rubrum CMCC（F）Tla）,标准须毛癣菌（Trichonphyton mentagrophyton CMCC（F）T5a）标准石膏样小孢子癣菌（Microsporum gypseum CMCC（F）M2a）为研究对象,对提取鉴定的砂仁不同部位挥发油进行体外抗菌实验,考察砂仁挥发油初步的体外抗菌活性。3.以羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）为包合材料,对砂仁挥发油进行包合,确定最佳的制备方法和制备工艺,并采用多种方法对包合物进行鉴定。4.以樟脑（CP Camphor）和乙酸龙脑酯（BA Bomyl Acetate）为测定指标,采用高效液相色谱法（HPLC）测定砂仁挥发油包合物中两种主要成分,确定含量测定方法,并考察砂仁挥发油包合物的稳定性及羟丙基-β-环糊精对挥发油的增溶作用。5.以CP和BA为考察测定指标,考察砂仁挥发油羟丙基-β-环糊精包合物和挥发油与羧甲基纤维素钠（CMC-Na）水溶液混合物在SD大鼠体内生物利用度。研究方法1.砂仁挥发油的提取及成分鉴定水蒸汽蒸馏提取法（HD Hydrodistillation）:取春砂仁,去壳,果仁与果壳分开粉碎,过24目筛网（2号标准筛）,取适量置圆底烧瓶中,按重量取1份原料加10倍量蒸馏水,浸泡过夜,安装挥发油提取器,电热套加热煮沸6 h,静置3h,使油水分离,收集提取中挥发油,无水乙醚反复洗涤提取器,减压回收乙醚,挥发油中加无水硫酸钠干燥除水,即得澄清挥发油。布莱-代尔提取法（B-D Bligh-Dyer）:B-D溶液的配制,参考文献。取粉碎药材适量,加入5倍量Bligh-Dyer混合溶剂（甲醇：氯仿：水=1：1：0.5V:V:V）,浸泡三天,超声处理（40℃,40 KHZ,45 min）,抽滤,重复提取三次,合并滤液,冰箱中储存过夜,4000 r·min-1离心5 min,取下层,于旋转蒸发仪中减压除去溶剂,即得挥发油。使用HP6890/5973 GC-MS联用仪,色谱柱为J&W DB-5MS毛细石英管柱（30 m×250μm×0.25μm）。柱温初始温度50℃,以5℃·min-1升至125℃（保持15 min）,再以5℃·min-1升至250℃。乙醚溶解样品；进样口为分流模式；气化温度为250℃；载气He为恒流模式,流速1.0 mL·min-1,平均线速37 cm·sec-1,分流比10：1,自动进样1.0μL；质谱条件：质谱电离能量70 eV,电子倍增管电压1905 V,离子源温度230℃,四极杆温度150℃,质量扫描范围30 amu-550 amu。使用Wiley275, NIST09质谱数据库进行计算机综合检索。2.砂仁挥发油体外抗菌活性研究2.1砂仁挥发油体外抗菌活性测定挥发油体外抗菌活性试验研究采用纸片扩散法测定挥发油对各菌的抑菌圈大小,采用沙保氏固体平板培养基。于6 mm纸片上分别加入10μL挥发油,10μL阳性对照（50μg·mL-1的酮康唑甲醇溶液）和溶剂阴性对照组,于28℃恒温培养72 h,每组平行处理三次。培养到规定时间后,测定挥发油对各菌的抑菌圈大小。判断标准为：>15mm为强抑菌活性,10mm-15mm为中等抑菌活性,<10mm为弱抑菌活性。3.砂仁挥发油包合物最佳制备工艺及鉴定取HP-β-CD适量,置100 mL具塞三角瓶中,加适量蒸馏水配成40%的HP-β-CD水溶液,于超声清洗仪中,40℃下缓慢加入挥发油的无水乙醇溶液（挥发油：乙醇=1:2 V:V）,超声包合至规定时间后,取出,用石油醚洗涤三次（每次5 mL）,除去未被包合的挥发油,冷冻结冰,置冷冻干燥机中干燥后,取出,置干燥器保存备用。以挥发油利用率、包合物含油率和包合物收率的综合得分为评价指标,对搅拌法、研磨法及超声法进行比较研究,优选包合方法,采用L9（34）正交试验法优选最佳包合工艺,并通过显微鉴别法、紫外分光光度法、差示扫描量热分析法（DSC）、气相色谱法等方法对包合物进行验证鉴别。3.包合物稳定性及增溶效果考察以CP和BA的为考察指标,采用HPLC法测定包合物及物理混合物中CP及BA的含量,分别称取包合物和挥发油与HP-β-环糊精的物理混合物适量,置密闭玻璃瓶中,于强光照（4000 lx）,高温（60℃）,高湿度（相对湿度90%）的环境下,分别于Od,2d,4d,6d,8d,10d取样,照含量测定项下方法测定CP和BA的含量,并采用相溶解度法测定羟丙基-β-环糊精对对挥发油的增溶作用。5.生物利用度研究取SD大鼠12只,给药前禁食12 h,不禁水,随机分为2组,每组6只,即挥发油组和挥发油-羟丙基-β-环糊精组,挥发油均匀混悬于0.15%CMC-Na水溶液中,A组灌胃挥发油包合物（水为溶剂,包合物中乙酸龙脑酯和樟脑含量为5.89%、2.70%）,B组灌胃挥发油混悬液（0.15%羧甲基纤维素钠水溶液为溶剂,挥发油中乙酸龙脑酯和樟脑含量为38.55%、17.49%）药物给药剂量为乙酸龙脑酯500mg/Kg,樟脑为230 mg/Kg,挥发油羟丙基-β-环糊精包合物直接溶于水以相同剂量灌胃,两给药组分别在0.167 h,0.5 h,1.0 h,2.0 h,3.0 h,4.0 h,6.0 h,8.0 h和12.0h于尾部静脉取血1.0 mL,置经肝素钠预处理的EP管中,8000 r/min离心10 min,取上清转移至另外一EP管中,于-20℃冰箱保存备用。6.统计学处理所有数据采用均数±标准差（x±s）表示,SPSS 13.0统计软件分析。采用的统计学方法有：1.挥发油抑菌实验数据结果分析采用One-Way ANOVA方法分析,结果只考虑各因素之间主效应,著性水准为a=0.05；2.包合工艺数据分析采用正交设计资料的方差分析,根据前期试验基础,只考虑主效应,显著性水准为a=0.05。3.包合物及物理混合物中主要成分稳定性采用重复测量数据的方差分析,稳定性结果中不同组别相同时间点的分析及药代动力学参数数据分析采用两独立样本t检验,显著性水准为a=0.05。研究结果1.通过GC-MS方法分析,从干燥成熟的砂仁种子和果壳四种挥发油提取物中共鉴定出138种化学成分,挥发油成分主要包括乙酸龙脑酯（5%-47%）、樟脑（4%-17%）、龙脑（1.5%-6%）、莰烯（0.2%-3%）、a-蒎烯（0.2%-3%）、β-蒎烯（0.2%-5%）以及a-柯巴烯（0.1%-2%）等,其中总烯类物质相对含量占总挥发油总成分的10%-40%。从该植物中首次鉴定出蓝桉醇、二环大根香叶烯、薄荷烯醇、二十三烷、二十四烷等新的化学成分35个。水蒸汽蒸馏法春砂仁种子挥发油的得率为3.57%（g*g）,果壳挥发油得率为0.97%（g/g）；Bligt-Dyer法提取挥发油得春砂仁种子挥发油得率为7.01%（g/g）,果壳中提取物得率为5.37%（g/g）。所得挥发油的抑制试验表明其对红色毛癣菌、须毛癣菌、石膏样小孢子癣菌均表现出一定的抑制活性。2.正交试验最佳包合方法为超声法,最佳包合工艺条件为：HP-β-CD与挥发油的投料比为10:1（g/mL）,HP-β-CD的浓度为40%,包合时间80min,包合温度55℃。因素A对包合工艺的影响有统计学意义（F=44.069,P=0.022）,因素B（F=3.231 P=0.236）,因素C（F=17.766,P=0.053）与因素D（F=0.046,P=0.956）对包合工艺的影响无统计学意义（P>0.05）。各种鉴定方法表明包合物制备成功且包合前后成分未见明显变化。3.HPLC法测定包合物中樟脑和乙酸龙脑酯的含量的最佳色谱条件为,色谱柱：Hypersil ODS C18柱（4.0 mm×250 mm,5μm）；流动相（甲醇-水75：25）；流速1 mL·min-1;检测波长210 nm；柱温30℃；进样量10μL。稳定性结果表明在高温高湿及强光照条件下,包合物中乙酸龙脑酯及樟脑的含量均高于物理混合物中的两种成分的含量,增溶试验显示HP-β-CD在50%浓度下可提高挥发油的溶解度约35倍。4.生物利用结果表明：两组大鼠分别灌胃包合物和混合物,于不同时间点测定血药浓度,得CP、BA的平均血药浓度-时间曲线,采用DAS 2.1.1软件计算求得各个药动学参数,对两组药动学参数进行两独立样本t检验分析,结果表明包合物组CP和BA的AUC0-t值、AUC0-∞值、Cmax值均高于混合物组。研究结论B-D提取法对砂仁挥发油的提取效率较常规HD法高,并且春砂仁挥发油对试验所选用真菌均有抑制效果,开辟了春砂仁在抗菌药物及食品防腐方面的新用途,为挥发油在医药产业及食品行业的开发利用提供了科学的理论与实验依据；包合物抗高温、高湿、强光照较物理混合物强,且羟丙基-β-环糊精可一定程度增加砂仁挥发油的溶解度。通过超声法制备所得的砂仁挥发油包合物在SD大鼠体内的生物利用度高于砂仁挥发油-CMC-Na混悬液在大鼠体内的生物利用度。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 砂仁挥发油的提取与分析及其抗菌活性研究
• 引言
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 第二章 砂仁挥发油羟丙基-β-环糊精包合物的制备
• 引言
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 第三章 砂仁挥发油包合物的稳定性及HP-β-CD对挥发油的增溶作用研究
• 引言
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 第四章 砂仁挥发油包合物在大鼠体内的药代动力学考察
• 引言
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 全文总结与展望
• 参考文献
• 中英文对照缩略词表
• 综述
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的论文及成果
• 致谢
• 统计学审稿证明