水稻bZIP类转录因子OsAREB1的功能分析

论文摘要

干旱、高盐和极端温度是诸多非生物逆境中对作物危害最为严重的自然灾害,长期以来,人们非常关注对这种非生物胁迫的研究。植物在感受环境胁迫信号后,会激活相应的信号转导途径,诱导大量胁迫应答基因表达,产生相应的胁迫应答反应,在这一系列的应答反应过程中,转录因子起着十分关键的作用。根据转录因子结构以及DNA结合活性等特点,将其分成若干个家族,如bZIP、AP2/EREBP、MYB、WRKY等,这些转录因子在胁迫响应过程中发挥着重要的作用。本研究从水稻植株cDNA文库中克隆到了编码完整开放阅读框的OsAREB1基因。使用RT-PCR对OsAREB1基因在水稻不同组织中以及不同激素和逆境胁迫下相对的转录水平进行了半定量分析。结果表明,OsAREB1基因的表达在根中最高,并且受ABA、PEG、NaCl和热的诱导,而与低温的关系不大。转录因子通过与顺式元件结合来调控下游基因的表达,本研究利用酵母单杂交实验验证了OsAREB1蛋白与ABRE顺式元件的结合能力,结果显示两者能结合。为了进一步分析OsAREB1基因的功能,通过蘸花法转化拟南芥,获得了过量表达OsAREB1的拟南芥植株。对转基因植株的分析表明,转基因植株对ABA有响应,但有组织差异性,如子叶对ABA不敏感而根对ABA敏感;转基因植株表现出较强的抗旱和耐热能力。测定转基因拟南芥的含水量和失水率发现,相对野生型拟南芥,转基因植株具有较高的含水量和较低的失水率。对抗逆基因RD29A、RD29B和ABA合成关键酶基因AtNCED3的RT-PCR检测发现,转基因植株中这三个基因的表达量都比WT植株高,且干旱和热激处理后这种差异更大。有趣的是,热处理前,转基因植株中热激蛋白HsfA2、HSP70和HSP80的表达量比WT高,而热处理后这些基因的表达量却没有差异,个中原因还有待研究。根据本研究的实验结果,可以推测OsAREB1参与ABA依赖的信号转导途径,且可以提高转基因拟南芥的抗干旱和耐热能力。但具体机理还需要进一步的研究。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号及缩略语说明
• 第一章 文献综述
• 1 植物抵御非生物胁迫的内源性保护物质及其作用机制
• 1.1 脯氨酸
• 1.2 甜菜碱
• 1.3 晚期胚胎发生丰富蛋白
• 1.4 糖类物质
• 2 参与植物环境胁迫响应的转录因子
• 2.1 bZIP 转录因子
• 2.1.1 bZIP 转录因子的结构特征
• 2.1.2 植物bZIP 蛋白与DNA 结合特性
• 2.1.3 植物bZIP 蛋白的功能和应用
• 2.2 AP2／EREBP 转录因子
• 2.3 WRKY 转录因子
• 2.4 MYB 转录因子
• 2.5 其他转录因子
• 3 逆境条件下ABA 依赖及ABA 非依赖基因的表达调控
• 3.1 ABA 依赖基因的表达
• 3.2 ABA 非依赖基因的表达
• 4 本研究的目的与意义
• 第二章 转录因子OsAREB1 的序列及表达特征
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 化学试剂和酶制剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 DNA 序列和数据分析
• 1.2.2 植物材料处理
• 1.2.3 水稻植株总RNA 的获得
• 1.2.4 RT-PCR 分析
• 2 结果与分析
• 2.1 OsAREB1 的序列分析和比对
• 2.2 OsAREB1 在水稻植株中的表达
• 2.3 OsAREB1 在水稻中的诱导表达
• 2.3.1 OsAREB1 激素诱导表达
• 2.3.2 OsAREB1 非生物胁迫诱导表达
• 3 讨论
• 第三章OsAREB1 与顺式元件ABRE 的体内结合
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 细菌菌株与质粒
• 1.1.2 化学试剂和酶制剂
• 1.1.3 试验相关溶液的配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 制备大肠杆菌E.coli DH5α感受态
• 1.2.2 pPCBP-OsAREB1 表达载体的构建
• 1.2.3 pPCBP-OsAREB1 质粒转化酵母
• 1.2.4 X-gal 显色反应
• 1.2.5 Lac Z 测活
• 2 结果与分析
• 2.1 鱼饵质粒的构建
• 2.2 pPCBP-OsAREB1 酵母表达载体的构建
• 2.3 酵母单杂结合实验
• 3 讨论
• 第四章 OsAREB1 在转基因拟南芥中的功能分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 细菌菌株和质粒
• 1.1.3 化学试剂和酶制剂
• 1.1.4 相关培养基和溶液的配制
• 1.1.5 测序
• 1.2 方法
• 1.2.1 含双CAMV 35S 启动子的双元载体YG8186 的构建
• 1.2.2 电击法转化农杆菌
• 1.2.3 拟南芥转化
• 1.2.3.1 拟南芥的培养
• 1.2.3.2 农杆菌的准备
• 1.2.3.3 拟南芥蘸花法转化
• 1.2.3.4 拟南芥种子的筛选
• 1.2.3.5 GUS 组织化学染色分析
• 1.2.4 转基因阳性植株的PCR 检测
• 1.2.4.1 拟南芥总DNA 的提取
• 1.2.4.2 PCR 检测
• 1.2.5 拟南芥转基因植株的功能分析
• 1.2.5.1 ABA 敏感测试
• 1.2.5.2 耐干旱测试
• 1.2.5.2.1 幼苗滤纸干旱
• 1.2.5.2.2 含水量和失水率的测定
• 1.2.5.3 耐热测试
• 1.2.5.4 抗逆相关基因及ABA 合成关键酶基因的RT-PCR 检测
• 2 结果与分析
• 2.1 农杆菌转化双元载体的构建
• 2.2 OsAREB1 基因的拟南芥转化及转基因纯系植株的鉴定
• 2.3 ABA 敏感测试
• 2.4 耐干旱实验
• 2.5 耐热实验
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢