TGF-β1对实验性自身免疫性脑脊髓炎C57BL/6小鼠TLR4、TLR9表达的影响

论文摘要

目的、通过TGF-β1对C57BL／6小鼠EAE模型进行干预，观察EAE小鼠的临床变化；并通过RT-PCR技术对TLR4、TLR9表达进行半定量分析，以比较TLR4、TLR9在不同时间点以及干预前后变化；从而进一步阐明两者在EAE中可能的作用机制以及TGF-β对TLR4、TLR9表达影响。方法72只近交系无特定病原体（SPF）级8—10周健康雌性C57BL／6J小鼠，体重18-22克，随机分为致病组、佐剂对照组以及干预组和干预对照组。各组中发病小鼠又分为发病初、发病高峰和慢性期组。用人工合成的MOG35-55和自制的完全弗氏佐剂免疫C57BL／6J小鼠制成慢性EAE动物模型，每只小鼠注射0.2ml，其中含人工合成的MOG35-55 300ug，完全福氏佐剂2mg，分4点皮下注射，基础免疫1周后用同样剂量加强免疫一次；免疫当天和48小时后经尾静脉注射百日咳毒素0.5mg。干预组操作同致病组并并在1，3，5，6，8，9，11天两次多点皮下注射1μgTGF-β1／100μlPBS／每只；佐剂对照组组除用同剂量的PBS代替MOG外，余与致病组无异。干预对照组免疫后用PBS代替TGF-β1干预，剂量和方法同干预组。免疫当天定为第0天起至第32天实验终止前，每天8AM—8PM观察动物行为活动，采用盲法，每天2人至少一次在同一时间称体重并按Benson评分标准做EAE严重性的临床评估，模型的成功与否主要根据Benson评分标准判定评价；利用RT-PCR技术观察各分组发病前、发病初、发病高峰和慢性期组脑和脊髓TLR4mRNA和TLR9mRNA的表达变化。结果1．动物模型本实验致病组小鼠累计有15／18（83.3％）的小鼠发病，有2／18小鼠（11.1％）死亡；14-20天开始发病，20-24天达高峰，28-32天进入慢性期。干预组累计有16／18（88.9％）的小鼠发病，其中死亡一只（5.6％）；13-17天开始发病，17-22天到达高峰期，22-24天到达缓解期。干预组比致病组发病提前但高峰期缩短。致病组小鼠发病期体重下降明显；干预组发病小鼠体重也明显减轻，且较早出现；干预对照组同致病组无显著差异。佐剂组没有发病，体重没有明显下降并呈增加趋势。2．RT-PCR：TLR4mRNA、TLR9mRNA的表达变化分别计算TLR4／β-actin的光密度值比值、TLR9／β-actin的光密度值比值。致病组和干预组各时期TLR4mRNA、TLR9mRNA表达均较佐剂对照组升高，并有统计学意义（P＜0.01）。致病组和干预对照组临床表现和各相应指标表达无差异。TLR4mRNA在致病组发病初期表达就已升高并达高峰；发病高峰期表达有所下降（P＜0.05）；慢性期表达继续下降，但和高峰期无明显差异（P＞0.05）。TLR4mRNA在干预组发病初期开始升高并在发病高峰期达到顶峰，慢性期有所下降且较高峰期有统计学差异（P＜0.05）；较致病组而言在各期均下降，并有显著差异（P＜0.01）。TLR9mRNA在致病组发病初期表达开始升高并于发病高峰期达高峰（P＜0.05）；慢性期表达稍有下降，但和高峰期无明显差异（P＞0.05）。TLR9mRNA在干预组发病初期开始升高并在发病高峰期达到顶峰，慢性期稍有下降但较高峰期无统计学差异（P＞0.05）；较致病组而言在各期均下降，并有显著差异（P＜0.01）。结论：1 TLR4、TLR9均在EAE的中枢神经系统病理发生发展过程发挥重要作用。2外源性TGF-β1可能通过下调TLR4、TLR9的表达对EAE的病理及病程产生双重影响。

论文目录

• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 缩略词简表
• 三、正文
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 2.1 药品与试剂
• 2.2 仪器
• 2.3 主要试剂及动物准备
• 2.4 动物分组
• 2.5 EAE模型的建立及干预方法
• 2.6 模型评价
• 2.7 RT-PCR
• 2.8 统计分析
• 第三章 结果
• 3.1 EAE小鼠行为及形态学变化
• 3.2 小鼠模型的发病率、体重及临床评分变化
• 3.3 小鼠模型的病理学变化
• 3.4 RT-PCR结果
• 第四章 讨论
• 4.1 干预前后EAE模型的变化
• 4.2 小鼠脑和脊髓中TLR4、TLR9mRNA的表达
• 4.3 TGF-β1干预后TLR4、TLR9mRNA的表达变化
• 第五章 结论
• 参考文献
• 四、综述
• 五、致谢