鼻咽癌中抑瘤基因DLC-1的表达及其失活机制和功能研究

论文摘要

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma,NPC）是我国南方省份及东南亚国家或地区高发的一种上皮源性恶性肿瘤,具有明显的种族聚集性和地域性。虽然目前对于鼻咽癌发病、早期诊断和治疗方面已经进行了比较深入的研究,但鼻咽癌发生发展的分子机制仍不甚清楚,而早期诊断和治疗也未取得重大突破。目前普遍认为EB病毒、化学致癌物和遗传易感性是鼻咽癌发生发展的三大要素。人们已经发现数十个与鼻咽癌相关的基因,并且以抑瘤基因研究更为多见。但这些基因只是鼻咽癌相关基因中的小部分,不足以很好地解释鼻咽癌发生和发展的分子机制。肝癌缺失基因-1（Deleted in Liver Cancer-1,DLC-1）由Yuan等于1998年通过代表性差异分析（representational difference analysis,RDA）方法首次从肝脏组织中克隆获得,是GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein,GAP）家族中的一员,通过激活Rho家族蛋白自身GTP酶活性而发挥作用。DLC-1在正常组织中广泛表达,但在多种肿瘤中都表达下调或缺失,并且这种表达失活与杂合性丢失（loss of heterozygous,LOH）、启动子甲基化有关。在肝癌、乳腺癌、非小细胞性肺癌、前列腺癌和多发性骨髓瘤等肿瘤细胞中恢复表达DLC-1,发现该基因不仅能抑制肿瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡,而且还参与抑制肿瘤细胞的侵袭。沉默DLC-1基因表达并结合c-Myc基因过表达可以在实验动物体内导致肝癌的形成。因此,DLC-1基因被认为是一个抑瘤基因。虽然Peng和Seng两个研究小组曾对DLC-1在鼻咽癌中的表达及其机制有所研究,但两者的研究方法和实验结果都存在诸多差异。因此,DLC-1在鼻咽癌中的表达及其失活的机制仍需进一步系统分析。另外,DLC-1在鼻咽癌中的作用也未见详细报道,仍有待进一步探讨。基于以上原因,本课题开展了对抑瘤基因DLC-1在鼻咽癌中的表达情况的分析,并尽可能地选择同一批标本,对其表达失活的可能机制进行探讨,同时,进一步考察了DLC-1在鼻咽癌细胞中的生物学功能。【DLC-1基因在鼻咽癌中的表达】本研究采用RT-PCR、Real-time PCR方法检测DLC-1在原代培养的胚胎鼻咽上皮细胞、正常鼻咽上皮细胞系、7株鼻咽癌细胞系和18例慢性鼻咽炎组织、32例鼻咽癌组织中的表达。结果发现,DLC-1在正常鼻咽细胞和88.9%（16/18）慢性鼻咽炎组织中正常表达,但在100%（7/7）鼻咽癌细胞系以及68.75%（22/32）鼻咽癌组织中的表达下调或缺失。同时,采用原位杂交和免疫组化分析DLC-1基因mRNA和蛋白在鼻咽部各种组织细胞中的定位和表达。结果表明,在假复层纤毛柱状上皮、复层鳞状上皮、腺上皮、炎症细胞和肿瘤细胞中均能检测到DLC-1 mRNA和蛋白不同程度的阳性表达,并且阳性信号定位于细胞胞浆中;同时,DLC-1蛋白在74.3%（26/35）的鼻咽癌组织中呈阴性或弱阳性表达;而且这种表达阴性率在不同临床分期的鼻咽癌中存在差异（P＜0.05）,TNMⅠ～Ⅱ期组和Ⅲ～Ⅳ组的阴性率分别是50%（6/12）和87%（20/23）,提示DLC-1与鼻咽癌的临床进程负相关。这为进一步分析基因表达异常的分子机制提供了依据。【探讨DLC-1在鼻咽癌中异常表达的可能机制】探讨抑瘤基因失活的机制主要从遗传学（genetic）改变和表观遗传学（epigenetic）改变两方面进行。首先,通过PCR-SSCP并结合测序的方法分析30例鼻咽癌中DLC-1的14个外显子和部分内含子突变情况,共检测出1个启动子区SNP位点（翻译起始位点上游-29位A/T SNP）、3个外显子区SNP、1个内含子SNP位点和8号外显子的1个错义突变,这个错义突变只在3.3%（1/30）鼻咽癌组织中存在。提示基因突变可能对于DLC-1表达失活的影响很小。为了考察位于DLC-1启动子区的SNP位点与鼻咽癌易感性的关系,我们在320例正常人外周血和201例鼻咽癌病人外周血中,采用Logistic回归分析方法对DLC-1-29 A/T SNP位点进行分析,结果显示,该位点与鼻咽癌的易感性没有关联,也与鼻咽癌的临床分期无关。其次,基因内部及其附近微卫星位点的丢失可以间接反映基因组中基因的缺失情况。采用PCR-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染方法,分析了DLC-1基因内部及其上下游两端的D8S552、D8S1754、D8S1790和D8S1827四个微卫星位点在鼻咽癌组织中的丢失情况。结果表明,至少有23.3%（7/30）的鼻咽癌组织中存在DLC-1基因微卫星位点的丢失。提示微卫星位点的LOH可能对DLC-1在鼻咽癌细胞中表达下调起一定的作用。再次,启动子区DNA异常甲基化是抑瘤基因在表观遗传学改变最为常见的方式。我们先通过生物信息学软件对DLC-1启动子区CpG分布情况进行分析。采用CpG Island Searcher软件分析了DLC-1cDNA转录起始位点上游-2005bp到下游355bp区域CpG分布情况,发现-592bp至+355bp区存在一个CpG岛。而-2005bp到-592bp区段只有散在CpG,不形成CpG岛。以正常人外周血细胞基因组DNA为模板,利用PCR技术,获得启动子区-1983/-377、-396/+16、-3/+339以及-396/+339共4个片段,通过荧光素酶报告基因活性分析,结果发现,-396/+16和-396/+339区段在鼻咽癌细胞系中具有启动子活性,-1983/-377和-3/+339不具备启动子活性。以-396至+16区域为模板,选择针对该区段的甲基化和非甲基化特异性引物,利用MSPCR（methylation-specific PCR）技术,在慢性鼻咽炎、鼻咽癌组织和鼻咽癌细胞系中分析DLC-1启动子甲基化情况。结果发现,7例鼻咽癌细胞系中,DLC-1启动子均发生了甲基化,82.1%（32/39）的鼻咽癌组织和11.1%（2/18）的慢性鼻咽炎组织发生启动子甲基化,鼻咽癌组织与慢性鼻咽炎组织相比,两者发生DLC-1启动子区高甲基化的几率存在明显的统计学差异（P=0.00）。去甲基化药物5-杂氮-2-脱氧胞苷能逆转鼻咽癌细胞5-8F和6-10B中DLC-1启动子甲基化状态,并上调DLC-1基因mRNA的表达。从另一侧面证明,启动子甲基化是导致基因表达下调的主要因素。综合DLC-1在鼻咽癌中的表达以及对突变、LOH和甲基化三种可能机制的分析结果,发现在表达下调的22例鼻咽癌组织中,只有4.5%（1/22）例既发生了甲基化改变也发生了外显子编码区突变,4.5%（1/22）的病例中DLC-1基因只发生了杂合性丢失,22.7%（5/22）的鼻咽癌组织中DLC-1基因既发生了杂合性丢失也发生了甲基化改变,而在68.2%（15/22）鼻咽癌组织中只检测到启动子区甲基化改变。进一步说明启动子区高甲基化是鼻咽癌组织中DLC-1表达失活的主要机制,同时,LOH也起部分的作用。为了研究哺乳动物中DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases,DNMTs）调控DLC-1基因启动子活性的作用,通过特异性瞬时干扰鼻咽癌5-8F细胞内DNMT1、DNMT3a和DNMT3b后,检测了DLC-1基因的表达状况。结果表明,DNMT1、DNMT3a和DNMT3b表达沉默后均能部分逆转5-8F细胞中DLC-1启动子甲基化状态,上调DLC-1基因mRNA的表达。其中,特异性干扰DNMT1后效果略为显著,提示DNMT1可能对于鼻咽癌中DLC-1启动子甲基化的作用较为重要。利用体外局部甲基化技术和荧光素酶报告基因分析系统,发现启动子-396至+16和-396/+339区段体外甲基化后,其启动子活性均受到抑制。这些结果可以进一步提示,与鼻咽癌中的表达下调或缺失密切相关的DLC-1启动子区的高甲基化可能主要通过DNMT1作用于启动子-396/+16区域实现的。【DLC-1在鼻咽癌细胞中的功能研究】为了进一步探讨DLC-1在鼻咽癌中的作用,我们以正常胚胎脾脏组织RNA为模板,利用RT-PCR技术,克隆获得包含DLC-1开放阅读框序列在内的3.3kb cDNA片段,经测序证实DLC-1 cDNA的+1380位点是一个错义SNP位点（V354M）,并经生物信息学分析推测该位点的多态性可能与DLC-1的生物学功能无关。将DLC-1基因的开放阅读框序列克隆到pcDNA3.1（+）载体中,构建了DLC-1基因的真核表达载体pcDLC1。利用脂质体转染技术将pcDLC1导入5-8F细胞,G418筛选获得抗性克隆,进一步采用RT-PCR检测DLC-1基因的mRNA表达,采用Western Blotting检测DLC-1蛋白的表达,结果表明我们已成功地建立稳定转染pcDLC1的5-8F细胞系5-8F-DLC1。免疫细胞化学实验显示表达的DLC-1蛋白主要定位于胞浆。随后我们检测了DLC-1基因稳定表达后对5-8F细胞的生物学特性的影响。利用MTT法和平板克隆形成实验观察DLC-1基因稳定表达后对5-8F细胞增殖能力和克隆形成能力的影响。MTT的结果表明5-8F-DLC1细胞的增殖速度明显低于转染载体组（P＜0.05）;平板克隆形成实验结果显示5-8F-DLC1细胞的克隆形成率明显低于转染载体组（23.1%vs 52.5%/49.4%）。流式细胞分析结果表明,与转染载体相比,转染pcDLC1后可以使5-8F细胞停滞于G0-G1期,G0-G1期细胞比例增加（67.25%vs 45.39%/46.53%）,S期（21.24%vs31.26%/31.55%）和G2-M期细胞比例减少（11.51%vs23.35%/21.92%）。裸鼠成瘤实验证实,转染DLC-1的5-8F细胞体内所成肿瘤的大小明显低于转染载体的5-8F细胞（P＜0.05）。提示DLC-1基因稳定表达后,在体外,通过使5-8F细胞停滞于G0-G1期导致5-8F细胞的增殖能力和克隆形成能力降低,在体内,肿瘤细胞的成瘤能力下降。另外,划痕实验、迁移实验和侵袭实验证实,DLC-1基因稳定表达后导致5-8F细胞运动能力和侵袭能力明显降低。利用phalloidin对细胞骨架进行染色,激光共聚焦显微镜观察发现,与未转染组和转染载体组比较,5-8F-DLC1细胞胞浆内肌动蛋白纤维丝明显减少,呈极性聚集在细胞周边。提示DLC-1基因可能是通过影响细胞骨架的形成而抑制鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力。综上所述,本课题在前期研究的基础之上,更系统、更全面地考察了抑瘤基因DLC-1在正常鼻咽细胞、鼻咽癌细胞、慢性鼻咽炎和鼻咽癌组织中的表达和分布情况,探讨了导致其表达失活的可能机制,并考察了DLC-1基因在鼻咽癌细胞中的功能。结果提示,DLC-1在慢性鼻咽上皮组织和正常鼻咽上皮细胞中正常表达,而在鼻咽癌组织和细胞中表达明显下调或缺失,这种表达失活主要是启动子高甲基化作用所致,LOH也发挥一定作用。通过在鼻咽癌细胞系中恢复DLC-1的表达发现,DLC-1能够抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力,降低了鼻咽癌细胞恶性程度。这些研究结果将有助于全面地了解DLC-1基因在鼻咽癌发生发展中的生物学功能,为进一步阐明鼻咽癌癌变的分子机制,也为其潜在的临床应用提供理论和实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 技术路线图
• 第一章 抑瘤基因DLC-1在鼻咽癌中的表达
• 第一节 材料和方法
• 1.材料
• 2.方法
• 第二节 实验结果
• 1.筛选标本
• 2.RNA质量检测
• 3.差异RT-PCR检测DLC-1基因在鼻咽癌及鼻咽炎组织中的表达情况
• 4.Real-time RT-PCR分析DLC-1的表达
• 5.RT-PCR与Real-time RT-PCR结果统计学分析
• 6.原位杂交检测DLC-1基因在正常上皮和鼻咽癌中的定位
• 7.DLC-1蛋白在鼻咽癌组织中的表达和定位
• 8.DLC-1基因mRNA水平以及蛋白水平表达的小结
• 第三节 分析与讨论
• 1.鼻咽癌标本的处理和激光捕获显微切割
• 2.real-time PCR技术
• 3.DLC-1基因在鼻咽癌中表达下调或缺失
• 第二章 探讨DLC-1基因在鼻咽癌中异常表达的可能机制
• 第一节 材料和方法
• 1 材料
• 2 主要方法
• 第二节 实验结果
• 1.DLC-1基因突变检测结果
• 2.DLC-1的-29位点（A/T）SNP与人鼻咽癌易感性的关联分析
• 3.DLC-1基因在鼻咽癌组织中LOH情况的分析
• 4.DLC-1基因在鼻咽癌细胞系及鼻咽癌组织中甲基化情况分析
• 5.5-Aza-Cd药物干预鼻咽癌细胞
• 6.甲基转移酶（DNMTs）对DLC-1表达的影响
• 7.局部甲基化分析DLC-1启动子活性的改变
• 第三节 分析与讨论
• 1.基因突变在DLC-1表达下调中的作用
• 2.LOH在DLC-1基因表达下调中的作用
• 3.DNA异常甲基化在DLC-1基因表达下调中的作用
• 4.启动子区异常甲基化是DLC-1表达下调或缺失的主要机制
• 第三章 DLC-1基因在鼻咽癌细胞中的功能研究
• 第一节 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• 第二节 实验结果
• 1 真核表达载体DLC-1/pcDNA3.1（+）的构建
• 2 建立稳定表达DLC-1基因的5-8F细胞系
• 3 稳定转染DLC-1基因对鼻咽癌细胞5-8F生物学特性的影响
• 第三节 分析与讨论
• 1.DLC-1抑制了鼻咽癌细胞的增殖能力
• 2.DLC-1抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭
• 3.DLC-1影响鼻咽癌细胞生物学特性的可能原因
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间主要研究成果目录