阿糖胞苷多囊脂质体的研究

论文摘要

阿糖胞苷是主要作用于细胞S增殖期的嘧啶类抗代谢药物，为细胞周期特异性药物，只有当细胞处于合成DNA的状态时，才能发挥作用，所以要在治疗的浓度下长时间的作用于肿瘤细胞。然而，阿糖胞苷的半衰期较短，在血及组织中很容易被胞嘧啶脱氨酶迅速脱氨而形成无活性的尿嘧啶阿拉伯糖苷。鞘内注射阿糖胞苷是预防和治疗神经系统白血病，淋巴瘤脑膜炎（lymphomatous meningitis）的重要方法。将阿糖胞苷制成可鞘内注射的长效制剂，可延长其在脑脊液的半衰期，降低毒副作用。多囊脂质体（multivesicular liposomes，MVLs）以其非同心圆的蜂窝状的独特结构，拥有非常优良的缓释能力，长达几天至数周。本文以阿糖胞苷为活性药物，研究了阿糖胞苷多囊脂质体（MVL-Cyt）的处方和制备工艺，对其理化性质和初步稳定性进行了评价；同时以阿糖胞苷水溶液剂为参比制剂，对MVL-Cyt的大鼠皮下注射给药的体内药物动力学行为进行考察。建立了阿糖胞苷的体外分析方法。采用高效液相色谱法测定阿糖胞苷的含量，分析方法简单可行，方法学符合要求。低速离心分离脂质体与游离药物，高效液相色谱法测定阿糖胞苷的含量，并计算脂质体包封率。回收率在95％～105％之间，方法准确，重现性好。采用复乳法（二次乳化法）制备MVL-Cyt，以包封率及显微镜下形态为指标，重点对处方和工艺参数进行了研究。处方中详细考察了赖氨酸类型及浓度，PC（EPC或DOPC）、DPPG、胆固醇（cholesterol，CH）的用量，内水相（inner aqueous phase）、外水相（outer aqueousphase）的pH，有机溶剂的选择等对MVL-Cyt包封率及显微镜下形态的影响；单因素考察对氮气流速，水浴温度，乳化强度等工艺参数进行优化。结果，选择进口游离型赖氨酸，PC、DPPG、CH的浓度分别为10、2、7．5mg·mL-1，内水相pH为1．0，氯仿-乙醚（1：1，v／v）的混合溶剂；氮气流速为0．3 m3·h-1，水浴温度37℃，一次乳化为14000 r·min-1高速搅拌8 min，制得的脂质体包封率最高，显微镜下形态最好。确定了MVL-Cyt最终处方及制备工艺为：DOPC、DPPG、CH、TO于氯仿-乙醚混合溶剂中，制成均匀混悬液；将35mg·mL-1盐酸阿糖胞苷水溶液（内水相，浓盐酸调pH至1．0）加至上述混悬液中，高速搅拌成初乳，用带细针头的玻璃注射器吸取初乳，快速注入4％葡萄糖和40 mmol·L-1。赖氨酸混合溶液（外水相）中，涡旋振荡10s成复乳，将复乳快速移至加有外水相的锥形瓶中，将锥形瓶置入37℃的水浴中，持续振摇，同时液面通氮气，复乳的浊度显著下降后，继续通氮气数分钟，即得脂质体混悬液。在脂质体混悬液中加入0．9％氯化钠注射液，混匀，600（?）g离心5min，弃去上清液，同法用0．9％氯化钠注射液洗涤沉淀3次。沉淀用0．9％氯化钠注射液稀释制成10mg·mL-1的阿糖胞苷多囊脂质体。对MVL-Cyt制剂的理化性质进行研究，包括外观、显微镜下形态、包封率、粒径及粒度分布、体外释放行为。将MVL-Cyt轻摇混匀，为白色混悬液；显微镜下其结构呈表面圆整的蜂窝状，无磷脂碎片；包封率较高，游离药低于10％；平均粒径19．49μm，跨距0．91，粒度范围较窄；以人空白血浆为释放介质，阿糖胞苷持续缓慢释放，两周释放约60％，无突释现象。初步稳定性实验结果为MVL-Cyt在4℃下一个月内Cyt含量、包封率、外观、pH值、粒径无明显变化。大鼠体内药物动力学研究，建立了阿糖胞苷血浆浓度的分析方法，内源性物质不干扰主药及内标阿昔洛韦的测定。分别皮下注射MVL-Cyt和Cyt水溶液剂，测定Cyt的血药浓度，用DAS 2．0软件分析计算出统计矩的药动学参数，结果，AUC分别为（43．89±9．82）和（104．18±9．54）μg·h·mL-1，MRT分别为（3．22±0．50）和（1．95±0．26）h，Cmax分别为（8．79±2．10）和（37．64±3．00）μg·mL-1，相对生物利用度40．98％。MVL-Cyt在注射部位停留，持续释放的少量阿糖胞苷在血内很快代谢至检测限以下，未能检测出缓释两周的效果；MVL-Cyt组Cmax降低明显，推测其毒副作用将减小。

论文目录

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英文摘要

前言

第一章 MVL-CYT体外分析方法的建立

1 仪器和试药

2 方法与结果

2.1 MVL-Cyt的含量测定

2.1.1 样品处理

2.1.2 色谱条件

2.1.3 色谱系统适用性试验

2.1.4 溶液的制备

2.1.5 测定法

2.1.6 方法学考察

2.2 MVL-Cyt的纯化方法及包封率测定方法

2.2.1 MVL-Cyt的纯化方法

2.2.2 纯化过程的影响因素考察

2.2.3 包封率测定方法

2.3 阿糖胞苷溶液稳定性考察

2.3.1 pH及温度对阿糖胞苷水溶液的影响

3 讨论

4 小结

参考文献

第二章 MVL-CYT的处方工艺研究

1 仪器和试药

2 方法与结果

2.1 给药剂量和规格

2.2 EPC筛选工艺和优化处方

2.2.1 EPC多囊脂质体的制备

2.2.2 复乳制备方式的选择

2.2.3 外水相pH对包封率的影响

2.2.4 盐酸赖氨酸浓度对包封率的影响

2.2.5 赖氨酸种类对包封率的影响

2.2.6 氮气流速的影响

2.2.7 水浴温度的影响

2.2.8 单因素考察EPC、CH、DPPG的用量

2.2.9 最优处方工艺的确定

2.3 DOPC筛选工艺和优化处方

2.3.1 工艺因素考察

2.3.1.1 一次乳化时间的考察

2.3.1.2 氮气流速的选择

2.3.1.3 水浴温度的影响

2.3.2 处方研究

2.3.2.1 有机溶剂的选择

2.3.2.2 内水相pH的确定

2.3.2.3 赖氨酸浓度的选择

2.3.2.4 甘油三酯的作用

2.3.2.5 载药量

2.3.2.6 正交试验

2.4 MVL-Cyt最优处方及工艺的确定

2.4.1 脂质体的制备

2.4.2 脂质体的纯化

2.4.3 三批样品的制备

3 讨论

4 小结

参考文献

第三章 MVL-CYT的理化性质及初步稳定性研究

1 仪器和试药

2 方法与结果

2.1 脂质体的制备

2.2 MVL-Cyt的理化性质考察

2.2.1 外观

2.2.2 粒子形态观察

2.2.3 粒径和粒度分布

2.2.4 pH值

2.2.5 包封率

2.2.6 体外释放度的研究

2.3 MVL Cyt的初步稳定性评价指标及结果

2.3.1 主药含量测定

2.3.2 pH值

2.3.3 外观

2.3.4 包封率

2.3.5 粒径

3 讨论

4 小结

参考文献

第四章 MVL-CYT的大鼠体内药物动力学研究

1 仪器和试药

2 方法与结果

2.1 大鼠血浆样品中阿糖胞普分析方法的建立

2.1.1 色谱条件

2.1.2 溶液的制备

2.1.3 血浆样品的预处理

2.1.4 方法的专属性

2.1.5 标准曲线的绘制

2.1.6 精密度和准确度

2.1.7 方法提取回收率

2.1.8 样品稳定性

2.2 大鼠体内药动学研究

2.2.1 给药方案与血浆样品的采集

2.2.2 实验结果

2.3 药动学参数计算

2.3.1 非隔室模型拟合统计结果

2.3.2 隔室模型拟合统计结果

2.4 相对生物利用度的计算

3 讨论

4 小结

参考文献

全文结论

致谢

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