异源抗生素生物合成调控基因对Streptomyces hygroscopicus TYQ0915菌株影响的初步研究

论文摘要

鉴于雷帕霉素药效强、价值高、产量低,本课题通过接合转移分别将3个异源抗生素生物合成调控基因：aveR, orfX和afsR基因整合至产雷帕霉素菌株Streptomyces hygroscopicus TYQ0915基因组中,构建了Streptomyces hygroscopicus AVH1124、Streptomyces hygroscopicus ORM1226和Streptomyces hygroscopicus AFH2028,从而初探异源aveR、orfX、afsR调控基因对Streptomyces hygroscopicus TYQ0915的影响,其中包括：1.研究aveR、orfX、afsR对Streptomyces hygroscopicus TYQ0915次级代谢的影响,结果aveR、orfX、afsR调控基因提高了的雷帕霉素产量,提高率分别为274.8%,20.7%和7.9%。2.研究aveR、orfX、afsR对Streptomyces hygroscopicus其他方面的影响,包括生物形态特征、自溶、生长周期、菌丝量和孢子量以及抗性影响。3.初探AveR, OrfX和AfsR调控蛋白对雷帕霉素生物合成的调控机制,比较不同类型(代表途径特异性调控基因的aveR、全局性调控基因afsR和未知类型的orfX)调控基因调控功能的差异。4.初步预测LAL调控蛋白家族保守序列,并讨论了aveR、orfX、afsR调控基因各自不同的拷贝数极限。5.同时,优化了最适E.coli和Streptomyces hygroscopicus TYQ0915的接合转移参数,雷帕霉素高产接合子初筛方法以及发酵培养基。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 链霉菌生物合成抗生素调控基因的研究
• 1.1.1 链霉菌抗生素生物合成基因簇
• 1.1.2 链霉菌抗生素生物合成调控基因对次级代谢的调控
• 1.1.2.1 途径特异性调控基因
• 1.1.2.2 全局性调控基因
• 1.1.2.3 双组分信号传导系统调控基因
• 1.1.2.4 其他调控基因
• 1.1.3 链霉菌抗生素生物合成调控基因对细胞分化的调控
• 1.1.4 链霉菌抗生素生物合成调控基因对抗生素产量的提高
• 1.2 吸水链霉菌产物雷帕霉素的理化性质和药理机制
• 1.2.1 雷帕霉素的理化性质
• 1.2.2 雷帕霉素的免疫抑制机制
• 1.2.3 雷帕霉素的构效关系
• 1.3 吸水链霉菌产物雷帕霉素的生物合成
• 1.3.1 雷帕霉素生物合成途径
• 1.3.2 雷帕霉素生物合成基因簇
• 1.4 课题研究内容和意义
• 1.4.1 研究背景和意义
• 1.4.2 研究内容和路线
• 第2章 E.coli工程菌的构建
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 E.coli感受态制备与DNA操作
• 2.3.2 E.coli培养与抗性筛选
• 2.3.3 质粒少量快速提取
• 2.3.4 电泳检测
• 2.4 实验结果
• 第3章 E.coli和Streptomyces hygroscopicus TYQ0915接合转移
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 E.coli发酵和Streptomyces hygroscopicus TYQ0915收集孢子
• 3.3.2 E.coli和Streptomyces hygroscopicus TYQ0915接合转移
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 接合转移参数优化
• 3.4.2 E.coli和Streptomyces hygroscopicus TYQ0915接合转移
• 第4章 接合子的分析
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料与试剂
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 双抗性筛选
• 4.3.2 链霉菌总基因快速提取
• 4.3.3 引物设计
• 4.3.4 PCR扩增
• 4.3.5 DNA纯化和回收
• 4.3.6 测序和分析
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 Streptomyces hygroscopicus AVH1124分析
• 4.4.2 Streptomyces hygroscopicus ORM1226分析
• 4.4.3 Streptomyces hygroscopicus AFH2028分析
• 4.5 小结
• 第5章 异源调控基因aveR、orfX和afsR对次级代谢产物产量的调控
• 5.1 实验材料与试剂
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 吸水链霉菌培养、菌体定量、发酵和保藏
• 5.2.2 甲醇粗提
• 5.2.3 细胞干重测定
• 5.2.4 HPLC检测
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 发酵培养基的优化
• 5.3.2 发酵时间的选择
• 5.3.3 异源调控基因aveR、orfX和afsR调控雷帕霉素产量的分析
• 第6章 异源调控基因aveR、orfX和afsR的其他影响
• 6.1 实验材料与试剂
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 八种培养基下菌株生物形态特征观察
• 6.2.2 搭片法显微镜和扫描电镜观察孢子和菌丝
• 6.2.3 接合子稳定性、抗性分析
• 6.3 实验结果
• 6.3.1 异源调控基因aveR、orfX和afsR对生物形态特征和生长周期的影响
• 6.3.2 异源调控基因对S.hygroscopicus菌丝、孢子和自溶的影响
• 6.3.3 接合子稳定性、抗性分析
• 第7章 AveR、OrfX和AfsR调控功能的探讨
• 7.1 实验方法
• 7.2 结合生物信息学探讨AveR调控蛋白的调控功能
• 7.3 LAL调控蛋白家族保守序列的预测
• 7.4 结合生物信息学探讨OrfX调控蛋白的调控功能
• 7.4.1 OrfX调控蛋白功能结构域的预测
• 7.4.2 OrfX调控S hygroscopicus TYQ0915的调控功能探讨
• 7.4.3 结合生物信息学探讨AfsR调控蛋白调控功能
• 7.4.4 aveR、orfX和afsR调控基因拷贝数的极限探讨
• 7.5 小结
• 7.6 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录1 雷帕霉素高产接合子初筛方法的优化
• 附录2 LAL调控蛋白家族比对
• 附录3 美国ISCC-NBS标准色彩（白色至黑色）
• 攻读硕士学位期间发表的论文及科研成果