农杆菌介导bdDREB2基因转化紫花苜蓿的研究

论文摘要

紫花苜蓿（Medicago sativa）是世界上栽培最早、分布最广、也是最为重要的一种多年生优质豆科牧草,由于其具有产量高、适口性好、蛋白质含量高等优点,素有“牧草之王”的美誉。近年来,紫花苜蓿在我国东北、华北以及西北等地被广泛种植,且其种植规模具有逐年扩大的趋势。近年来,随着气候条件的恶化,干旱和水资源的匮乏成为了限制我过农业发展的重要因素,同时也限制了紫花苜蓿的种植及畜牧业的发展。近年来通过基因改良技术改造植物品种,成为生物工程研究的一个热点。为培育出具有抗旱能力的紫花苜蓿品种,本研究选取由中国农业科学院畜牧兽医研究所牧草育种研究室通过常规育种技术育成的紫花苜蓿品种“中苜一号”作为基因转化受体,分别选用胚根、下胚轴及子叶作为转化受体,进行组织培养学系统研究,寻找相对分化率较高的外植体和适合于该品种的培养基搭配,测定了最佳菌液工作浓度、侵染时间、共培养时间等要素。并利用农杆菌介导的方法,将从野牛草（Buchloe dactyloides（Nutt.） Engelm.）中克隆得到的抗逆基因BdDREB2导入紫花苜蓿“中苜一号”中。获得如下实验结果:1、胚根、下胚轴和子叶愈伤率均较高,但胚根和下胚轴不易分化出胚状体,子叶相对愈伤率低于下胚轴,但分化率较高。适合作为转化受体。最适合培养基搭配为:UM培养基为最佳诱导愈伤培养基和胚状体分化培养基;1/2MS为最佳诱导生根培养基。2、农杆菌菌液最佳工作浓度为OD600≈0.6;侵染时间为10 min;共培养时间为3d。3、最佳转化体系为:诱导愈伤培养基: UM+2,4-D 2 mg/L+KT 0.25 mg/L+Cef 500 mg/L+Kan 75 mg/L最佳分化培养基: UM+KT 2 mg/L+Cef 500 mg/L+Kan 75 mg/L最佳生根培养基: 1/2MS4、获得8个转化株系,通过PCR分子鉴定,获得4株阳性苗。阳性率为50%。RT-PCR检测结果表明目的基因已经整合到苜蓿基因组中;Southern blot分析表明,BdDREB2基因已经稳定整合到转基因植株的基因组中。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 1 绪论
• 1.1 植物抗旱转录因子的研究进展
• 1.1.1 植物抗旱机制
• 1.1.2 植物中的抗旱基因的种类
• 1.1.3 植物抗旱相关调节基因
• 1.1.4 信号传导相关蛋白
• 1.1.5 转录因子相关蛋白
• 1.1.6 抗旱相关功能基因
• 1.2 DREB 转录因子的结构功能及其在抗逆中的研究进展
• 1.2.1 DREB 转录因子的结构
• 1.2.2 DREB 转录因子的功能
• 1.2.3 DREB 转录因子在植物抗逆中的研究进展
• 1.3 研究目的与意义
• 2 紫花苜蓿高频再生组织培养体系的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 不同来源组织对愈伤组织诱导率、体胚诱导率及成苗率的影响
• 2.2.2 不同再生方案对体胚诱导率的影响
• 2.2.3 不同再生方案对成苗率的影响
• 2.2.4 高频再生体系的建立
• 2.3 讨论
• 2.3.1 不同外植体材料对愈伤形成的影响
• 2.3.2 激素和培养基对愈伤组织的诱导影响
• 3 根癌农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化体系的建立与优化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 培养基的配制
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 选择培养基中抑菌抗生素的浓度对农杆菌菌液的影响
• 3.2.2 选择培养基中筛选抗生素的浓度对愈伤组织的影响
• 3.2.3 不同浓度的农杆菌菌液对愈伤组织的影响
• 3.2.4 不同浸染时间对愈伤组织的影响
• 3.2.5 不同共培养时间对农杆菌生长状态的影响
• 3.2.6 抗生素对愈伤组织诱导的影响
• 3.3 讨论
• 4 BDDREB2 基因转化苜蓿及转基因植株的鉴定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 培养基的配制
• 4.1.3 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 表达载体的鉴定
• 4.2.2 目的基因BdDREB2 对苜蓿的转化
• 4.2.3 转基因苜蓿的PCR 检测
• 4.2.4 转基因苜蓿的RT-PCR 检测
• 4.2.5 转基因苜蓿的southern 检测
• 4.3 结果与讨论
• 5 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录