论文摘要
在我国,胃癌的发病率很高,由于胃癌筛查没有得到普及和重视,大多数胃癌到中晚期才得到诊断,化疗仍是主要的治疗手段。但是肿瘤原发或继发性耐药的产生致使肿瘤对化疗不敏感,最终导致治疗的失败。多年来对耐药相关基因功能的研究揭示了众多的耐药机制,在指导临床治疗中逐渐显示出重要的作用,然而由于这些基因之间相互缺乏联系,因而所进行的研究也相对独立。近年来研究显示一类长度为2125 nt的单链非编码微小RNA（microRNA）在肿瘤发生发展中发挥着重要的作用。生物信息学显示microRNA通过调节不同的基因而发挥重要的生物学效应,从而使一些看似相互独立的基因之间建立了紧密的联系。在肿瘤耐药方面,研究显示相同microRNA能够通过调控不同的靶点而影响肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。在胃癌化疗临床药物的选择中,顺铂（cisplatin,CDDP）仍是基础化疗药物之一。SGC7901/CDDP是胃癌顺铂耐药的细胞株。虽然已有一些关于其耐药机制的报道,但是目前尚未有对该细胞的microRNA表达谱特征的报道,同时microRNA在胃癌顺铂耐药过程中所起的作用也没有深入的研究。本研究对SGC7901/CDDP细胞的耐药特性进行了分析;对SGC7901/CDDP及其亲代顺铂敏感的SGC7901细胞进行microRNA表达谱的高通量筛选,通过与SGC7901细胞microRNA的表达谱进行对比,筛选出其中差异表达的microRNA,并应用靶点预测软件进行靶点预测及生物信息学分析,寻找潜在的microRNA靶点或调控通路,以期改善胃癌细胞的耐药问题。在建立SGC7901/CDDP细胞microRNA表达谱的基础上,进一步探讨了microRNA-200c对胃癌SGC7901/CDDP细胞耐药及增殖的影响,并观察了其对E-cadherin、PTEN/Akt通路及凋亡蛋白Bcl-2和BAX的调控作用。同时通过抑制高表达E-cadherin的SGC7901细胞中E-cadherin的表达,观察细胞的耐药性和增殖能力的改变和PTEN/Akt通路及凋亡蛋白Bcl-2和BAX的变化,分析E-cadherin对细胞耐药和增殖的影响及其机制,探讨E-cadherin是否介导了microRNA-200c对PTEN/Akt通路及凋亡蛋白的间接调控。第一部分胃癌SGC7901/CDDP细胞microRNA表达谱及其生物信息学分析目的:研究SGC7901/CDDP细胞的耐药特性,通过对比SGC7901/CDDP耐药细胞与亲代细胞microRNA表达谱的差异,尝试在microRNA水平寻找到胃癌细胞耐药的机制和改善耐药的潜在治疗靶点。方法:采用MTT法检测SGC7901/CDDP及SGC7901细胞对顺铂、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇的药物敏感性;采用microRNA芯片检测两株细胞的microRNA表达谱并进行比对筛选出差异表达的microRNA;对异常表达的microRNA分别应用TargetScan （http://www.targetscan.org/）及MicroCosm Targets Version 5 （http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/ htdocs/targets/v5/）预测microRNA靶点,并进行比对后筛选出两种方法均能预测到的共同的靶点;同时根据靶点所对应的microRNA表达改变情况将靶点分为microRNA表达降低组和microRNA表达增高组。对microRNA表达降低组和microRNA表达增高组的靶点进一步采用Blast2GO进行在线批量GO分析（http://www.blast2go.org/startblast2go）,对靶点的生物学进程进行注释,预测microRNA参与的生物学功能。结果:1两株细胞对顺铂、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇的敏感性:不同浓度的顺铂、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇作用48h后,SGC7901/CDDP及SGC7901两株细胞的存活率不同。SGC7901/CDDP细胞对顺铂、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇的IC50分别为:11.245±0.272mg/L、0.763±0.043mg/L、12.154±2.036mg/L和3.277±0.426mg/L;SGC7901细胞对顺铂、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇的IC50分别为:2.206±0.256mg/L、0.229±0.020mg/L、4.481±0.544mg/L和1.528±0.097mg/L。与SGC7901细胞相比,SGC7901/CDDP对顺铂、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇的IC50均显著高于SGC7901细胞（P<0.05）,SGC7901/CDDP对四种抗肿瘤药物的敏感性降低。2 RNA的质量检测:从SGC7901/CDDP及SGC7901细胞提取出总RNA的浓度分别为:1145.77mg/L和1853.74mg/L,A260/A280值均在1.92.0之间,从甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果来看,其18S和28S条带清晰,亮度比约为1:2,总RNA纯度达到实验要求且无明显降解。3 microRNA芯片检测结果:经Hy3荧光标记、纯化,进行芯片杂交,图像采集,数据进行归一化处理后,以两种细胞Hy3荧光标记信号强度的比值≤0.5或≥2为标准判定差异表达microRNA。结果显示:与SGC7901细胞相比,SGC7901/CDDP细胞中表达下调超过2倍的microRNA有14个,分别为: microRNA-33a、microRNA-200c、microRNA-302c*、microRNA-488、microRNA-148a、microRNA-141、microRNA-212、microRNA-576-3p、microRNA-660、microRNA-338-3p、microRNA-24-1*、microRNA-589、microRNA-887和microRNA-22*;表达上调超过2倍的microRNA有5个,分别为:microRNA-1246、microRNA-943、microRNA-1290、microRNA-516a-5p和microRNA-34b。4 microRNA预测靶点的生物信息学分析结果:microRNA表达降低组共有451个预测靶点,Blast2GO分析显示这些靶点参与信号转导、转录调控、蛋白质磷酸化、跨膜转运、药物敏感性、细胞周期、分化、凋亡、增殖、粘附、DNA修复等生物学进程。microRNA表达增高组共有98个预测靶点,Blast2GO分析显示这些靶点参与信号转导、转录调控、跨膜转运、细胞周期、凋亡、增殖、分化、组织发生等生物学进程。结论:1与亲代胃癌SGC7901细胞比较,胃癌SGC7901/CDDP细胞除了对顺铂耐药性显著增高外,其对阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇的耐药性也出现增加,呈现出多药耐药的表型。2通过利用microRNA芯片筛选出胃癌顺铂耐药SGC7901/CDDP细胞及其亲本SGC7901细胞之间差异表达的microRNAs ,其中microRNA-33a、microRNA-200c、microRNA-302c*、microRNA-488、microRNA-148a、microRNA-141、microRNA-212等14个microRNAs在SGC7901/CDDP细胞中表达下调、microRNA-1246、microRNA-943、microRNA-1290、microRNA-516a-5p、microRNA-34b在SGC7901/CDDP细胞中表达上调。3通过对这些异常改变microRNA的预测靶点进行GO分析,提示这些异常表达的microRNA具有复杂的生物学效应,表明多个microRNA参与了SGC7901/CDDP细胞的多药耐药。第二部分microRNA-200c对胃癌SGC7901/CDDP细胞耐药和增殖的影响目的:microRNA-200c是我们在上一部分实验中通过microRNA芯片筛选出的SGC7901/CDDP耐药细胞与亲代SGC7901细胞表达差异的microRNA。本部分实验试图进一步验证microRNA芯片筛选的结果,同时通过改变microRNA-200c的表达探索其对SGC7901/CDDP细胞药物敏感性及增殖所起的作用。方法:采用实时荧光定量PCR对microRNA芯片筛选出的microRNA-200c的表达水平进行验证;采用siPORT? NeoFX? Transfection Agent将microRNA-200c前体（pre-200c）或阴性对照序列转染到SGC7901/CDDP细胞中,转染24h后提取细胞总RNA采用实时荧光定量PCR检测microRNA-200c表达水平的改变;采用MTT法检测转染后的SGC7901/CDDP细胞对顺铂、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇敏感性的改变;采用细胞计数法检测转染后的SGC7901/CDDP细胞体外增殖能力的改变。结果:1 microRNA-200c在两株细胞中表达的差异:实时荧光定量PCR结果显示:SGC7901/CDDP细胞microRNA-200c的△Ct为15.470±0.036,SGC7901细胞的△Ct为14.657±0.229。SGC7901/CDDP细胞microRNA-200c的相对表达水平是SGC7901细胞的0.573±0.084倍,显著低于敏感株细胞的表达（P<0.05）。2 SGC7901/CDDP细胞转染24h后microRNA-200c的表达改变:实时荧光定量PCR结果显示SGC7901/CDDP细胞转染pre-200c 24h后microRNA-200c的△Ct为12.660±0.079,阴性对照组△Ct为15.493±0.080。细胞转染pre-200c 24h后microRNA-200c相对表达水平是阴性对照组的7.128±0.159倍（P<0.05）。3 microRNA-200c对SGC7901/CDDP细胞耐药性的影响:转染pre-200c后的SGC7901/CDDP细胞增加了对顺铂、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇的敏感性。IC50分别为:7.518±0.186mg/L、0.381±0.053 mg/L、7.267±0.090mg/L及1.705±0.332mg/L;阴性对照组分别为:12.180±0.294 mg/L、0.721±0.034 mg/L、11.534±0.598mg/L及3.140±0.403mg/L。两者差异显著（P<0.05）。4 microRNA-200c对SGC7901/CDDP细胞增殖能力的影响:转染pre-200c的SGC7901/CDDP细胞接种后从第3天开始细胞数目显著低于阴性对照组（P<0.05）,增殖能力显著降低。结论:1通过实时荧光定量PCR证实microRNA-200c在胃癌顺铂耐药细胞株SGC7901/CDDP中表达下调,验证了microRNA芯片的结果。2上调microRNA-200c的表达能显著增加SGC7901/CDDP细胞在体外对顺铂、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇四种抗肿瘤药物的敏感性,发挥化疗增敏作用。3上调microRNA-200c的表达能显著抑制SGC7901/CDDP细胞的体外增殖能力。第三部分microRNA-200c逆转SGC7901/CDDP细胞耐药及抑制增殖的分子机制目的:为了明确microRNA-200c逆转SGC7901/CDDP细胞耐药及抑制增殖的分子机制,我们试图通过分析SGC7901/CDDP耐药细胞与亲代SGC7901细胞一些相关蛋白E-cadherin、PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX表达的差异,以及microRNA-200c表达增加后这些蛋白表达水平的变化,寻找microRNA-200c调控的相关蛋白及使SGC7901/CDDP细胞发生耐药的效应蛋白。方法:采用Western blot法检测SGC7901/CDDP及SGC7901细胞中E-cadherin、PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白表达差异;采用siPORT? NeoFX? Transfection Agent将pre-200c或阴性对照序列转染到SGC7901/CDDP细胞中,转染后72h提取细胞总蛋白,采用Western blot法检测转染后的SGC7901/CDDP细胞E-cadherin、PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白表达的改变。结果:1两株细胞中E-cadherin、PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白表达:SGC7901/CDDP细胞E-cadherin、PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白的相对表达量分别为:0.098±0.030、0.178±0.064、1.019±0.093、1.181±0.102、0.267±0.018和0.215±0.026;SGC7901细胞E-cadherin、PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白的相对表达量分别为:0.467±0.061、0.874±0.056、0.166±0.017、1.231±0.163、0.108±0.011和0.366±0.017。与SGC7901细胞相比,SGC7901/CDDP细胞中p-Akt和Bcl-2蛋白的相对表达量显著增高（P<0.05）,而E-cadherin、PTEN和BAX蛋白的相对表达量显著降低（P<0.05）,总Akt的相对表达量在两组之间未见显著差异（P>0.05）。2 microRNA-200c对SGC7901/CDDP细胞E-cadherin、PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白表达的影响:SGC7901/CDDP细胞转染pre-200c后E-cadherin、PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白的相对表达量分别为:0.471±0.010、0.589±0.016、0.220±0.035、1.255±0.116、0.074±0.008和0.380±0.008;阴性对照组的E-cadherin、PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白的相对表达量分别为:0.109±0.002、0.111±0.002、0.687±0.086、1.291±0.117、0.442±0.020和0.111±0.005。转染pre-200c组细胞的E-cadherin、PTEN、BAX蛋白的相对表达量显著高于阴性对照组（P<0.05）,而p-Akt及Bcl-2蛋白的表达显著低于阴性对照组（P<0.05）,总Akt的相对表达量在两组之间未见显著差异（P>0.05）。结论:1 SGC7901/CDDP细胞耐药表型与E-cadherin、PTEN及BAX蛋白表达的下降、Akt通路激活和Bcl-2蛋白的表达增加有关。2 microRNA-200c对SGC7901/CDDP细胞耐药逆转和增殖抑制的作用与诱导E-cadherin、PTEN及BAX蛋白的表达、抑制Akt通路的激活和下调Bcl-2蛋白的表达有关。第四部分E-cadherin siRNA对SGC7901细胞耐药与增殖的影响及分子机制研究目的:前一部分的研究结果提示microRNA-200c参与调控一系列耐药相关蛋白,为了进一步探讨microRNA-200c与这些蛋白以及这些蛋白彼此之间的信号传导顺序,我们根据其它研究的结果,研究E-cadherin是否介导了从microRNA-200c传导下来的调控信息,同时探讨E-cadherin对SGC7901细胞耐药和增殖的影响。方法:采用Lipofectamine 2000将E-cadherin siRNA或其阴性对照序列转染到SGC7901细胞中,转染后24、48、72h分别提取细胞总蛋白采用Western blot检测转染后细胞的E-cadherin蛋白的抑制效率;SGC7901细胞转染24h后采用MTT法检测转染后的SGC7901细胞对顺铂、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇敏感性的改变,采用细胞计数法检测转染后的SGC7901细胞体外增殖能力的改变;SGC7901细胞转染72h后提取细胞的总蛋白,采用Western blot检测转染后细胞的PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白表达的改变。结果:1 SGC7901细胞转染后的E-cadherin蛋白表达改变:SGC7901细胞转染E-cadherin siRNA 24、48和72h后E-cadherin蛋白的相对表达量分别为:0.244±0.006、0.155±0.007和0.118±0.014,阴性对照组为0.527±0.006,转染E-cadherin siRNA后E-cadherin蛋白的表达受到显著抑制（P<0.05）。2 SGC7901细胞转染E-cadherin siRNA后对化疗药物敏感性的改变:转染E-cadherin siRNA后的SGC7901细胞降低了对顺铂、阿霉素、5-氟脲嘧啶和紫杉醇的敏感性。IC50分别为:4.375±0.199 mg/L、0.368±0.042mg/L、6.855±0.780 mg/L和2.530±0.259mg/L;阴性对照组分别为:2.882±0.166 mg/L、0.228±0.012mg/L、4.058±0.946 mg/L和1.483±0.225mg/L。两组差异显著（P<0.05）。3 E-cadherin siRNA对SGC7901细胞增殖能力的影响:转染E-cadherin siRNA的SGC7901细胞接种后从第4天开始细胞数目显著高于阴性对照组（P<0.05）,细胞的增殖能力显著增强。4 E-cadherin siRNA对SGC7901细胞PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白表达的影响:转染E-cadherin siRNA 72h后SGC7901细胞的PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白的相对表达量分别为:0.148±0.010、0.455±0.034、1.045±0.182、0.328±0.014和0.139±0.013;转染阴性对照序列72h后SGC7901细胞的PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白的相对表达量分别为:0.531±0.014、0.224±0.049、1.158±0.143、0.114±0.012和0.369±0.016。转染E-cadherin siRNA 72h后SGC7901细胞的p-Akt和Bcl-2蛋白的相对表达量显著高于阴性对照组,而PTEN和BAX蛋白的相对表达量显著低于对照组（P<0.05）,总Akt的相对表达量在两组之间未见显著差异（P>0.05）。结论:1抑制E-cadherin的表达能显著降低SGC7901细胞在体外对顺铂、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇四种抗肿瘤药物的敏感性,增强了细胞对化疗药物的耐受。2抑制E-cadherin的表达能显著改变SGC7901细胞的体外增殖能力,导致细胞增殖能力增加。3抑制E-cadherin表达导致的SGC7901细胞耐药和增殖与下调PTEN及BAX蛋白的表达、激活Akt信号通路和上调Bcl-2蛋白的表达有关。4在胃癌细胞中,microRNA-200c可能是通过E-cadherin通路对PTEN/Akt信号通路及凋亡蛋白Bcl-2和BAX的调节而发挥逆转细胞耐药和增殖抑制作用。
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相关论文文献
- [1].雷公藤甲素通过抑制microRNA-21的表达提高SGC7901/CDDP细胞顺铂敏感性[J]. 江苏大学学报(医学版) 2012(03)
- [2].莪术油含药血清逆转胃癌SGC7901/CDDP多药耐药的研究[J]. 中药新药与临床药理 2012(05)