流感病毒H1N1型神经氨酸酶基因的克隆与表达

论文摘要

流行性感冒每年不同规模的小流行和若干年一次世界范围的大流行,给人类的身体健康和经济发展带来了严重危害。神经氨酸酶是流感病毒重要的结构蛋白,是诱导体液免疫的关键靶抗原。目前,针对神经氨酸酶的药物主要是神经氨酸酶抑制剂,处于研究阶段的有以神经氨酸酶蛋白为基础的疫苗、以神经氨酸酶基因为基础的核酸疫苗等。由于针对神经氨酸酶基因的流感疫苗研制是比较有发展前景的领域,所以本研究目的是利用基因克隆技术把A/WSN/1933（H1N1）的神经氨酸酶NA1基因克隆到表达载体内,得到有活性的神经氨酸酶蛋白,注射到小鼠体内,使其产生特异性免疫应答,利用单克隆技术得到单克隆并纯化抗体,对抗体进行免疫实验,以获得神经氨酸酶蛋白疫苗。或者是把阳性重组子质粒通过肌肉注射、基因枪等方法导入体内,在体内表达流感病毒抗原蛋白,从而诱导免疫系统对流感病毒抗原发生特异性免疫应答,以获得神经氨酸酶核酸疫苗。本研究利用PCR技术扩增H1N1型流感病毒的神经氨酸酶的cDNA得到相应的DNA,并将PCR产物连接到克隆载体PMD18-T,然后转化到大肠杆菌DH5α,鉴定得到的阳性克隆菌株。然后把NA1基因与表达载体PET21a-d（+）连接并转入到大肠杆菌BL21中,筛选正确的阳性重组子,经酶切和PCR鉴定,证明成功构建了重组载体PET21-NA1,并且利用Ni-NTA琼脂糖纯化获得了神经氨酸酶蛋白质,这为神经氨酸酶蛋白疫苗和神经氨酸酶核酸疫苗的研究打下了重要基础,也促进了人们对H1N1流感病毒的认识和理解,对于防治由H1N1病毒引起的大流感也有一定意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 流感概述
• 1.2 流感病毒概述
• 1.2.1 流感病毒的分类和命名
• 1.2.2 流感病毒的形态和结构
• 1.2.3 流感病毒的基因和产物
• 1.2.4 流感病毒的抗原变异
• 1.2.5 流感病毒的理化特性
• 1.3 神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）
• 1.3.1 神经氨酸酶的结构
• 1.3.2 神经氨酸酶的功能
• 1.3.3 神经氨酸酶在流感病毒跨宿主传播中的作用
• 1.4 H1N1亚型流感病毒
• 1.5 流感疫苗的研究进展
• 1.5.1 正在应用的流感疫苗
• 1.5.2 研制中的流感疫苗
• 1.6 针对神经氨酸酶的流感治疗方法
• 1.6.1 神经氨酸酶抑制剂药物
• 1.6.2 神经氨酸酶蛋白疫苗
• 1.6.3 神经氨酸酶核酸疫苗
• 1.7 本研究的目的意义
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.2 载体
• 2.1.3 菌种
• 2.1.4 主要工具酶及试剂
• 2.1.5 PCR引物
• 2.1.6 实验所用试剂和配制
• 2.1.7 实验仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 重组克隆载体PMD-NA1的构建
• 2.2.2 表达载体PET21-NA1的构建
• 2.2.3 阳性重组菌株的表达与保存
• 2.2.4 蛋白质的纯化
• 3 结果与分析
• 3.1 重组克隆载体pMD-NA1的构建与鉴定
• 3.1.1 目的DNA的获得
• 3.1.2 重组克隆载体阳性菌株的鉴定
• 3.2 表达载体PET21-NA1的构建与鉴定
• 3.2.1 表达载体PET21-NA1的构建
• 3.2.2 两种酶切方法的比较
• 3.2.3 阳性重组子的鉴定
• 3.3 阳性重组子的诱导表达
• 3.3.1 培养液不同OD值对表达产物的影响
• 3.3.2 诱导剂的浓度对表达产物的影响
• 3.3.3 温度对表达产物的影响
• 3.3.4 诱导时间对表达产物的影响
• 3.4 蛋白质纯化
• 4 讨论
• 4.1 关于引物的设计和PCR条件的确定
• 4.2 关于两种酶切方法的对比
• 4.3 关于表达载体和宿主菌的选择
• 4.4 关于进一步研究神经氨酸酶蛋白疫苗的讨论
• 4.5 关于进一步研究神经氨酸酶核酸疫苗的讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 论文发表情况