商品脂肪酶降解壳聚糖机理研究

论文摘要

商品脂肪酶具有非专一性降解壳聚糖的活力,但对于脂肪酶降解壳聚糖的机理在国内外均未见报道。本论文研究商品脂肪酶对壳聚糖的降解特性以及作用机理,这对于阐明非专一性酶水解壳聚糖机理具有重要的理论价值和学术意义,同时对于指导低分子量壳聚糖（LMWC）和甲壳低聚糖（COS）的工业化酶法生产也具有重要的现实意义。首先从四种不同来源的商品脂肪酶中选择了一种来源于Aspergillus Oryzae的具有较强壳聚糖水解活力的脂肪酶,研究了该酶降解壳聚糖的特性,并对该酶降解壳聚糖的产物进行了分析。脂肪酶对不同脱乙酰度（DD）的壳聚糖均有显著的水解作用,作用于DD为64%、73%、82%和90%的壳聚糖的最适pH值分别为4.2、4.4、4.6和5.0,最适温度均为60℃。脂肪酶水解不同DD壳聚糖的反应均遵循Michaelis-Meten方程,动力学分析结果表明DD值为73%和82%的壳聚糖是脂肪酶较容易水解的底物。脂肪酶催化壳聚糖降解可生成各种聚合度（DP = 26）的低聚糖,但在反应的最后,产物仅剩下氨基葡萄糖（GlcN）,这表明在脂肪酶中存在外切酶。脂肪酶催化不同DD壳聚糖水解生成的产物完全相同。采用超滤、DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析、Phenyl Sepharose CL-4B疏水作用层析和Sephacryl S-200凝胶过滤层析等一系列分离纯化操作,从脂肪酶中分离得到一个具有壳聚糖酶活力但不具有脂肪酶活力的酶组分。HPLC结果表明纯化酶的纯度达到99%以上,SDS-PAGE结果表明纯化酶已经达到均一。由于分离纯化过程中其他组分均不具备壳聚糖酶活力,因此说明脂肪酶的壳聚糖酶活力是由纯化酶的水解作用引起的。SDS-PAGE测得纯化酶的分子量约为74 kDa,而在非还原SDS-PAGE条件下纯化酶条带出现在130 kDa附近,表明纯化酶由两个相对分子质量相同的亚基组成,而且这两个亚基通过二硫键连接在一起。利用氨基酸自动分析仪测定了纯化酶的氨基酸组成,结果表明天冬氨酸和谷氨酸含量较高,组氨酸、精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸的含量较低;含硫氨基酸的含量都非常低,而丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸和丙氨酸等中性氨基酸的含量都较高。采用Edman降解法测得纯化酶N-末端12个氨基酸的序列为Ala– Leu– Arg– Leu– Asn– Ser– Pro– Asn– Asn– Ile– Ala– Val。在非冗余蛋白质序列（ Non-redundant protein sequences）数据库中采用NCBI Blastp2程序对测得的N-末端氨基酸序列进行相似性比较,发现该酶与来自米曲霉的一个蛋白质具有很高的相似性,12个氨基酸序列的区域一致性达到100%。采用DEPC、NBS、Ch-T、EDAC、PMSF、CHD、NAI、DTNB和DTT等化学修饰剂对纯化酶的氨基酸残基进行修饰,研究了纯化酶中必需基团的组成。DEPC对酶的修饰结果表明有1分子组氨酸残基位于纯化酶的活性中心;利用NBS修饰酶蛋白,结果表明色氨酸残基处于酶的活性中心,且至少有1分子色氨酸残基位于酶活性中心的底物结合部位;Ch-T和EDAC对酶的修饰结果表明甲硫氨酸残基和羧基也是酶的必需基团。利用PMSF、CHD、NAI、DTNB和DTT分别对酶分子中的羟基、精氨酸残基、酪氨酸残基、巯基和二硫键进行修饰,结果表明这些修饰剂在较高的浓度范围内均没有引起酶活的显著降低,因此羟基、精氨酸残基、酪氨酸残基、巯基和二硫键都不是维持酶活的必需基团。研究了纯化酶的酶学性质,结果表明纯化酶在pH 4.6时的活力较高,在pH4.5 9.5之间具有较好的稳定性;在60℃时活力达到最高,在低于60℃的温度下时具有较高的热稳定性。Ni2+、Co2+和Mn2+等金属离子对酶的活力具有明显的激活作用,而Fe3+、Sn2+、Pb2+和Hg2+则能强烈抑制酶活,其中Hg2+的抑制能力最强,Na+、K+、Mg2+、Zn2+和Cd2+对酶活的影响较小。纯化酶对于DD为73%、81%和82%的壳聚糖显示了较高的水解活力,而对DD为64%和90%的壳聚糖的水解活力较低。通过TLC法和HPLC法分析纯化酶降解已知结构甲壳低聚糖和乙酰甲壳低聚糖的产物,研究了纯化酶的作用模式。结果表明纯化酶以外切的形式作用于甲壳低聚糖,并将单糖GlcN顺次从甲壳低聚糖的末端释放出来,这与氨基葡萄糖苷酶（GlcNase）的作用模式是一致的;同时纯化酶以外切酶的形式作用于乙酰甲壳低聚糖的末端,并依次将乙酰甲壳二糖[（GlcNAc）2]释放出来,这是乙酰甲壳二糖苷酶典型的作用模式。因此该酶同时具有GlcNase活力和乙酰甲壳二糖苷酶活力,既能水解壳聚糖中GlcN-GlcN之间的糖苷键,也能水解GlcNAc-GlcNAc之间的糖苷键。本论文通过超滤、凝胶过滤层析、疏水作用层析和离子交换层析等分离纯化技术,从脂肪酶中得到了一种具有壳聚糖水解活力但不具有脂肪酶活力的酶组分,该酶具有GlcNase和乙酰甲壳二糖苷酶双重活力,说明该酶的水解作用是脂肪酶降解壳聚糖的主要原因,从而阐明了商品脂肪酶非专一性降解壳聚糖的机理。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 立题背景和意义
• 1.2 脂肪酶结构和功能研究进展
• 1.2.1 脂肪酶简介
• 1.2.2 脂肪酶的底物特异性
• 1.2.3 脂肪酶的结构
• 1.2.4 脂肪酶结构和专一性的关系
• 1.2.4.1 底物结合部位
• 1.2.4.2 盖子
• 1.3 壳聚糖的酶法降解研究进展
• 1.3.1 壳聚糖的专一性酶法降解研究进展
• 1.3.2 壳聚糖的非专一性酶法降解研究进展
• 1.3.2.1 纤维素酶
• 1.3.2.2 果胶酶
• 1.3.2.3 蛋白酶
• 1.3.2.4 脂肪酶
• 1.4 非专一性酶降解壳聚糖机理研究进展
• 1.5 课题的研究目的和内容
• 1.5.1 课题研究目的
• 1.5.2 课题的研究内容
• 参考文献
• 第二章 脂肪酶降解壳聚糖的特性研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与试剂
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 主要试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 壳聚糖脱乙酰度（DD）的测定
• 2.3.2 壳聚糖酶粘均分子量的测定
• 2.3.3 pH 值对各种脂肪酶水解壳聚糖的的活力影响
• 2.3.4 温度对各种脂肪酶水解壳聚糖的活力的影响
• 2.3.5 pH 值对脂肪酶水解不同DD 壳聚糖活力的影响
• 2.3.6 温度对脂肪酶水解不同DD 壳聚糖活力的影响
• 2.3.7 脂肪酶与不同DD 值壳聚糖的结合能力研究
• 2.3.8 脂肪酶降解壳聚糖产物研究
• 2.3.8.1 水解产物的红外光谱分析
• 2.3.8.2 水解产物的薄层层析（TLC） 分析
• 2.3.9 壳聚糖酶活力的测定
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 脂肪酶的壳聚糖酶活力
• 2.4.1.1 pH 值对各种脂肪酶水解壳聚糖活力的影响
• 2.4.1.2 温度对各种脂肪酶水解壳聚糖的活力的影响
• 2.4.2 pH 值对脂肪酶降解不同DD 值壳聚糖活力的影响
• 2.4.3 温度对脂肪酶降解不同DD 值壳聚糖活力的影响
• 2.4.4 脂肪酶与不同DD 值壳聚糖的结合能力
• 2.4.5 壳聚糖水解过程中还原糖含量的变化
• 2.4.6 壳聚糖水解过程中的粘度变化
• 2.4.7 脂肪酶水解壳聚糖产物分析
• 2.4.7.1 壳聚糖水解产物的红外光谱分析
• 2.4.7.2 壳聚糖水解产物的TLC 分析
• 2.5 本章小结
• 参考文献
• 第三章 脂肪酶中具有壳聚糖酶活成分的分离纯化和纯度鉴定
• 3.1 前言
• 3.2 材料与试剂
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 主要试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 脂肪酶中壳聚糖降解活力组分的分离纯化
• 3.3.1.1 提取缓冲液的选择
• 3.3.1.2 超滤
• 3.3.1.3 阴离子交换层析
• 3.3.1.4 疏水相互作用层析
• 3.3.1.5 凝胶过滤层析
• 3.3.2 纯化酶的纯度鉴定
• 3.3.3 纯化酶的分子量测定
• 3.3.3.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 3.3.3.2 非还原SDS-PAGE
• 3.3.4 壳聚糖酶活力测定方法
• 3.3.5 脂肪酶活力测定方法
• 3.3.6 蛋白质含量测定
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 提取缓冲液的选择
• 3.4.2 超滤
• 3.4.3 脂肪酶中具有壳聚糖降解活力组分的纯化
• 3.4.3.1 阴离子交换层析
• 3.4.3.2 疏水相互作用层析
• 3.4.3.3 凝胶过滤层析
• 3.4.4 HPLC 鉴定纯化酶的纯度
• 3.4.5 纯化酶的纯度鉴定和相对分子质量的测定
• 参考文献
• 第四章 脂肪酶中具有壳聚糖降解活力酶组分的结构与活性部位研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与试剂
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 主要试剂
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 纯化酶的氨基酸组成分析
• 4.3.2 纯化酶N-末端氨基酸列的测定
• 4.3.3 组氨酸的修饰
• 4.3.3.1 DEPC 浓度的测定
• 4.3.3.2 DEPC 修饰
• 4.3.3.3 羟胺对修饰酶活力的恢复作用
• 4.3.4 色氨酸的修饰
• 4.3.5 甲硫氨酸的修饰
• 4.3.6 羧基氨基酸的修饰
• 4.3.7 羟基的修饰
• 4.3.8 精氨酸的修饰
• 4.3.9 酪氨酸的修饰
• 4.3.10 巯基的修饰
• 4.3.11 二硫键的修饰
• 4.3.12 壳聚糖酶活测定
• 4.3.13 蛋白质含量测定
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 氨基酸组成分析
• 4.4.2 N-末端氨基酸序列测定
• 4.4.3 组氨酸的化学修饰
• 4.4.4 色氨酸的化学修饰
• 4.4.5 甲硫氨酸的化学修饰
• 4.4.6 羧基的化学修饰
• 4.4.7 羟基、精氨酸、酪氨酸和二硫键的修饰
• 4.4.8 巯基的修饰
• 4.5 本章小结
• 参考文献
• 第五章 具有壳聚糖酶活力组分的酶学性质及作用模式研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与试剂
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 主要试剂
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 pH 值对纯化酶活性的影响
• 5.3.2 pH 值对纯化酶稳定性的影响
• 5.3.3 温度对纯化酶活力的影响
• 5.3.4 温度对纯化酶稳定性的影响
• 5.3.5 纯化酶水解壳聚糖动力学研究
• 5.3.6 底物专一性测定
• 5.3.7 金属离子对酶活力的影响
• 5.3.8 纯化酶水解氨基葡萄糖低聚糖和乙酰氨基葡萄糖低聚糖
• 5.3.9 TLC 法分析壳聚糖酶水解产物
• 5.3.10 HPLC 法分析酶水解产物
• 5.3.11 壳聚糖酶活力测定
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 pH 值对酶活力的影响
• 5.4.2 pH 值对酶稳定性的影响
• 5.4.3 温度对酶活力的影响
• 5.4.4 温度对酶稳定性的影响
• 5.4.5 底物专一性测定
• 5.4.6 纯化酶水解壳聚糖的动力学
• 5.4.7 金属离子对酶活力的影响
• 5.4.8 TLC 法分析纯化酶水解甲壳低聚糖产物
• 5.4.9 HPLC 法分析纯化酶水解甲壳低聚糖产物
• 5.4.10 TLC 法分析纯化酶水解乙酰甲壳低聚糖产物
• 5.4.11 HPLC 法分析纯化酶水解乙酰甲壳低聚糖产物
• 5.5 本章小结
• 参考文献
• 主要结论
• 论文创新点
• 附录
• 作者在攻读博士学位期间发表的论文
• 致谢