组氨酸激酶在马尔尼菲青霉菌中的功能研究

论文摘要

在环境中存在的超过100,000种不同种类的真菌中,存在二态性的致病真菌:皮炎芽生菌（Blastomyces dermatitidis）,粗球孢子菌（Coccidioides immitis）,组织胞浆菌（Histoplasma capsulatum）,巴西副球霉菌（Paracoccidioidesbrasilliensis）,申克氏胞丝菌（Sporothrix schenckii）和马尔尼菲青霉菌（Penicilliummarneffei）。一旦这种二态性致病真菌的孢子侵入宿主体内,其形态就会由在外界环境的菌丝态转换为致病性的酵母形态。马尔尼菲青霉菌是青霉菌种中唯一具有温度控制的二态性致病菌。马尔尼菲青霉菌广泛分布于中国南部及东南亚地区,能引起呼吸道、皮肤以及系统性霉菌病,特别是在免疫功能低下和艾滋病病毒感染的患者中。为更好的探讨马尔尼菲青霉菌的致病机制及其潜在的致病基因的功能,有必要对马尔尼菲青霉菌中一些与致病相关的重要基因进行深入的功能研究。本实验研究的重点是双组分调控系统-组氨酸激酶,它是二态性真菌感知和适应环境的的主要信号通路。最近的研究表明组氨酸激酶能够调控不同的过程,包括二次代谢产物的生成,并与植物和动物的病原菌的致病性有关。本研究在马尔尼菲青霉菌的cDNA文库中获得一个新型的组氨酸激酶基因PmHHK1,构建了针对PmHHK1的干扰载体,通过RNA干扰技术,利用根癌农杆菌介导的转化方法来对其进行功能研究。干扰载体以木糖诱导的xylp为启动子。PmHHK1的基因干扰后马尔尼菲青霉菌生长受到抑制,孢子生成数量减少,细胞壁成分发生变化,一些致病因子及相关的调控基因出现下调。实验表明,PmHHK1基因对于调控马尔尼菲青霉菌的生长发育,致病性方面均有调控作用。双组分调控系统广泛存在于真核生物中,而在哺乳动物中确未被发现,因此可作为抗真菌病药物的潜在靶点进行进一步的研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第1章 绪论
• 第1节 马尔尼菲青霉菌介绍
• 1.1 马尔尼菲青霉菌及其流行病学意义
• 1.2 马尔尼菲青霉菌致病性和二态性
• 1.3 生活周期
• 1.4 马尔尼菲青霉菌分子生物学研究现状
• 第2节 信号转导通路-双组分调控系统在真菌中的作用
• 2.1 信号转导通路
• 2.2 双组分调控系统-组氨酸蛋白激酶
• 2.3 真菌中的双组分调控系统
• 2.4 下游调控通路
• 2.5 双组分调控系统与抗微生物药物研究
• 第3节 根癌农杆菌介导的RNA干扰技术
• 3.1 RNAi技术
• 3.2 根癌农杆菌介导的转化体系
• 第4节 论文的研究基础及主要内容
• 参考文献
• 第2章 组氨酸激酶基因RNA干扰菌株的构建与鉴定
• 第1节 前言
• 第2节 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 第3节 结果与讨论
• 3.1 PmHHK1基因全序列扩增及序列分析
• 3.2 干扰载体pCB309A-xhght的构建
• 3.3 马尔尼菲青霉的转化效率和转化质量
• 3.4 PmHHK1基因RNA干扰菌株的表型变化
• 3.5 利用RT-PCR在分子生物学水平分析干扰效果
• 参考文献
• 第3章 组氨酸激酶基因功能研究
• 第1节 前言
• 第2节 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 第3节 结果与讨论
• 3.1 组氨酸激酶基因沉默后马尔尼菲青霉菌的表型变化
• 3.2 组氨酸激酶基因沉默后马尔尼菲青霉菌的孢子生成变化
• 3.3 在电子显微镜下观察干扰菌株的生长形态
• 3.4 组氨酸激酶基因沉默后马尔尼菲青霉菌细胞壁组分合成的影响
• 3.5 组氨酸激酶基因沉默后对马尔尼菲青霉菌的下游调控基因的影响
• 第4节 马尔尼菲青霉菌MAPK基因功能研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.3 结果与分析
• 第5节 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录