草酸青霉菌（Penicillium oxalicum）产壳聚糖酶发酵条件及酶性质研究

论文摘要

本研究针对目前国内所报道的壳聚糖酶的酶活力普遍偏低、真正产酶量大且适用于工业化大规模生产的菌种很少、商品壳聚糖酶价格居高不下的问题,以得到具有工业化潜在应用价值的酶源为目标,开发海洋微生物资源,获取新颖的产壳聚糖酶的海洋真菌一株,对该菌所产壳聚糖酶进行了发酵条件、酶的纯化和酶学性质等方面的研究,为大规模微生物产壳聚糖酶的生产及其应用提供实验依据;具有很好的理论研究价值和实用意义。通过研究得到如下实验结果:⑴通过菌落的形态观察、电子显微镜观察和rDNA-ITS相结合的现代分子生物学方法等多项指标进行鉴定为:草酸青霉菌（Penicillium oxalicum）,标记为:Penicillium oxalicum PCS-7。这是首次发现该菌具有产壳聚糖酶的能力。⑵对发酵产酶培养基进行优化:①采用寡营养培养基（蛋白胨9 g,葡萄糖10 g,壳寡糖10 g,pH 7.2,海水）进行发酵研究,发现Penicillium oxalicum在改良后的寡营养培养基中的生长量和产酶量基本不受营养条件贫瘠的影响;研究表明该菌发酵产酶所需培养基中可以直接利用海水而不必添加额外的无机盐成分,这样可以省掉在培养基中添加无机盐,同时可以减少发酵时所需的淡水消耗量,降低发酵培养基成本。②本研究进一步尝试多种廉价原料进行发酵产酶实验,结果表明:采用培养基成分（g/L）:黄豆粉25 g,壳寡糖14 g,海水,pH值自然;在温度为25℃、摇床转速为150 rpm条件下,培养4 d,酶活力达到最大值为8.5 U/mL。本研究显示:可以利用黄豆粉海水培养基进行发酵产壳聚糖酶,该培养基的成本不足原发酵培养基的5%,大大降低了壳聚糖酶产生菌培养基的成本。⑶壳聚糖酶的纯化研究中发现,Penicillium oxalicum在采用黄豆粉培养基进行发酵的过程中,分泌胞外壳聚糖酶。发酵液经过冷冻离心后,胞外酶液即为相对较纯壳聚糖酶液;SDS-PAGE电泳检测该壳聚糖酶分子量为42 kDa。⑷酶学性质研究表明:酶适宜的反应条件:温度为50℃,pH值为6.0,添加Mg2+、Mn2+和Ca2+对酶活性具有激活作用;具有较好的低温稳定性和较强的耐酸性;酶动力学参数:最大反应速度Vmax=0.05 mg/（mL·min）,米氏常数Km=9.02 mg/mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 研究意义
• 1.2 壳聚糖酶的研究进展
• 1.2.1 壳聚糖酶的发现及测定方法
• 1.2.2 壳聚糖酶来源及性质
• 1.2.3 壳聚糖酶纯化方法的研究
• 1.2.4 壳聚糖酶分子水平的研究
• 1.2.5 壳聚糖酶的作用方式及功能
• 1.2.6 壳聚糖酶的应用及展望
• 1.3 壳聚糖酶研究中尚存在的主要问题
• 1.4 本课题研究的目的、主要内容
• 1.5 本课题的创新点
• 参考文献
• 第二章 壳聚糖酶产生菌的筛选和分类鉴定
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 主要试剂和材料
• 2.2.2 主要仪器
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 壳聚糖酶产生菌的初筛
• 2.2.5 壳聚糖酶产生菌的复筛
• 2.2.6 壳聚糖酶产生菌的分类和鉴定
• 2.2.7 壳聚糖酶活力测定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 壳聚糖酶产生菌的平板筛选
• 2.3.2 壳聚糖酶产生菌液体发酵产酶复筛
• 2.3.3 壳聚糖酶产生菌电子显微镜观察结果
• 2.3.4 菌株rDNA-ITS 序列分析鉴定结果
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 Penicillium oxalicum 产壳聚糖酶发酵条件的研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 主要试剂和材料
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 培养基
• 3.2.4 发酵过程参数测定
• 3.2.5 发酵培养基配方的研究
• 3.2.6 发酵操作参数的变化对产酶的影响
• 3.2.7 廉价培养基的寻找及优化
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 发酵过程参数测定结果
• 3.3.2 不同发酵培养基配方对发酵产酶的影响研究结果
• 3.3.3 发酵操作参数的变化对产酶的影响结果
• 3.3.4 廉价培养基的寻找及优化
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 Penicillium oxalicum 产壳聚糖酶的纯化及酶学特性的研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 主要试剂和材料
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 两种粗酶液的制备
• 4.2.4 测定方法
• 4.2.5 壳聚糖酶的纯化
• 4.2.6 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 4.2.7 壳聚糖酶性质研究
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 两种壳聚糖商品Ⅰ、Ⅱ的分子量测定
• 4.3.2 寡营养培养基所产粗酶液和廉价培养基所产粗酶液蛋白检测结果
• 4.3.3 寡营养培养基所产粗酶液的初步纯化结果
• 4.3.4 廉价培养基产壳聚糖酶冻干后活力变化
• 4.3.5 壳聚糖酶性质研究
• 4.3.6 产物酶解程度的初步判断结果
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 结论和建议
• 结论
• 建议
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢