论文摘要
研究背景：中风具有高发病率、高致残率、高复发率,仅中国每年便新增150-200万病例,其中,缺血性脑中风为最常见中风类型,占全部中风的60-80%。越来越多研究表明,炎症过程参与中风后损伤级联反应,可能是造成脑缺血后再灌注损伤的主要原因。早期溶栓、抗凝治疗为循证医学确认的有效治疗方法,但存在严格的时间窗限制,在长期恢复过程中效果不显著。大量临床资料和实验研究表明,针刺为治疗缺血性脑中风的有效手段,急性期、恢复期、后遗症及康复期均有显著效果。研究目的：本课题通过观察针刺干预脑缺血再灌注模型大鼠后,中枢损伤局部、对侧脑组织和外周血中应激-损伤-修复信号链中关键信号的动态变化,从信号传导链、病程发展过程、机体功能整体调控的综合角度,探讨针刺治疗脑缺血再灌注后炎症损伤的机制,用现代生物医学研究手段,阐明针灸对损伤-应激与损伤-修复相关疾病过程的作用机制,为临床治疗方案提供确切的实验室依据。研究方法：1、将大鼠按随机数字表分成空白对照组、假手术组和模型对照组,每组10只动物。对造模后动物进行神经功能评分,采用TTC染色观察大脑梗死情况,HE染色观察脑组织形态学变化。2、将大鼠按随机数字表分成空白对照组（10只动物）、假手术组（10只动物）和造模组,造模成功（根据神经功能评分）的大鼠根据随机数字表又分为模型对照组、尼莫地平组、针刺治疗组（百会透刺印堂配伍人中穴）,共4组,每组又分为12h、24h、48h.72h.96h.144h6个时程,每个时程10只动物。取外周血清,ELISA（?）去检测炎性反应相关应激信号-ACTH,内源性危险信号-Hsp70,启动和调节信号-IL-6,IL-1β,损伤效应信号-TNFα的含量；取脑组织,冰冻切片,免疫组化检测患侧与健侧脑组织中炎性反应相关信号：启动和调节信号-IL-6、IL-1β,损伤效应信号-TNFα,MMP-9,局部炎症损伤相关粘附、趋化因子-ICAM-1,MCP-1,以及修复信号-TGFβ的表达。3、将大鼠按随机数字表分成空白对照组（10只动物）和造模组,造模成功（根据神经功能评分）的大鼠根据随机数字表又分为模型对照组、针刺治疗1组（百会透刺印堂配伍人中穴）、针刺治疗2组（百会配伍患侧足三里穴）,共4组,每组又分为12h、24h、48h、72h、96h、144h6个时程,每个时程10只动物。取取脑组织,冰冻切片免疫组化检测患侧组织中IL-6,TNFα,MCP-1,TGFβ的表达。研究结果：1、模型评价：TTC染色发现缺血局部脑组织出现典型染色缺失,呈现白色,与大脑中动脉支配区域相符,视交叉前后梗死灶比较稳定。HE染色镜下观察发现,梗死中心区染色变浅,细胞数目减少,细胞核固缩,核仁变小,形态不规则；问质水肿；内皮细胞肿胀；可以见到大量网格状空泡。2、针刺对血清中炎性反应相关信号的影响：脑缺血再灌注模型大鼠血清中炎性反应相关信号ACTH,IL-1β,IL=6,TNF α,Hsp70,在损伤发展过程中呈现典型双峰曲线模式,且各信号变化趋势相似。ACTH在12h到达第一峰峰值,在48h达第二.峰峰值；IL-1β, IL-6, TNFα, Hsp70均在24h到达第一峰峰值,在72-96h达第二峰峰值。假手术组ACTH,IL-6,TNFα,Hsp70呈现相似双峰表达趋势,IL-1β仅72h高于生理水平。给予百会透刺印堂配伍人中电针治疗后,可显著下调外周血请中炎性反应信号ACTH,IL-1β,IL-6,TNF α, Hsp70的第一峰表达水平；显著下调ACTH,IL-1β,TNFα的第二峰表达水平;上调1L-6的第二峰表达水平。3、针刺对脑组织中炎性反应相关信号的影响：脑缺血再灌注模型大鼠患侧脑组织中炎性反应相关信号IL-6,IL-1β,MMP-9, ICAM-1,MCP-1,TGFβ,在损伤发展过程中呈现典型双峰曲线模式；均在12-24h到达第一峰峰值;IL-6在96h时到达第二峰峰值；IL-1β,MMP-9在48h即到达第二峰峰值；ICAM-1,MCP-1,TGFβ在72h到达第二峰峰值；TNFα第一峰于第二峰融合,12h开始持续增高,24h到达峰值,保持较高水平至72h。假手术组呈现相似表达趋势。脑缺血再灌注模型大鼠健侧脑组织中炎性反应相关信号均呈现典型双峰信号IL-6,IL-1β,TNFα,ICAM-1,MCP-1,TGFβ在12-24h到达第一峰峰值；IL-6在96h时到达第二峰峰值；IL-1β自48h持续增高,144h时到达最高值；TNFα在48h到达第一峰峰值；ICAM-1,MCP-1,TGFβ在72h到达第二峰峰值；MMP-9在48h达到第一峰峰值,自72h持续增高,144h到达最高值。假手术组呈现相似表达趋势。模型大鼠给予百会透刺印堂配伍人中电针治疗后,对双侧脑组织中炎性反应相关信号的影响是：对患侧脑组织中IL-6,IL-1β,TNFα,MMP-9,MCP-1,TGFβ的表达水平均有全程下调作用；对健侧脑组织中IL-6,MMP-9,MCP-1,TGFβ的表达水平均有全程下调作用；对健侧脑组织中IL-6,MMP-9损伤急性期（48h）的表达水平有上调作用；而针刺治疗组ICAM-1的表达在患侧脑组织中72h前呈增高趋势,在健侧脑组织中48h前呈增高趋势。针刺治疗后,患侧脑组织中IL-6,ICAM-1第二峰的表达提前出现；健侧脑组织中,IL-6,IL-1β,MMP-9,ICAM-1,MCP-1,TGFβ第二峰的表达提前出现。4、针刺不同穴组对患侧脑组织中炎性反应相关信号的影响：百会穴配伍足三里穴电针治疗,对比选取百会透刺印堂配伍人中穴,能够显著下调模型大鼠患侧脑组织中炎性反应相关信号：IL-6,TNFα,MCP-1,TGFβ的全程表达水平和第一峰、第二峰的峰值；IL-6,TGFβ第二峰的表达提前。研究结论：1、血管内栓阻断线法脑缺血再灌注大鼠模型,造成大脑中动脉供血区域的梗塞并产生功能障碍,且具有一定的稳定性；脑缺血再灌注损伤启动了机体局部与整体,包括外周血清、双侧脑组织中炎性／免疫相关的应激-损伤-修复信号链；模型复制成功。2、电针百会透刺印堂配伍人中穴对机体应激-损伤-修复信号链发挥网络调节作用,整体影响了外周血清、双侧脑组织中炎性反应相关应激信号、内源性危险信号、启动和调节信号、损伤效应信号、联络信号、修复信号的表达；电针可能通过抑制机体过度应激、减轻炎性损伤过程、促进细胞间联系、提前启动修复功能、调动健侧脑组织进行调节代偿减轻缺血再灌注损伤。3、百会配伍足三里穴对比百会透刺印堂配伍人中穴,能够更好调节机体对炎症应激、损伤的反应,减轻炎性反应及炎症损伤,更早启动修复功能；提示头部穴位、肢体穴位联合运用干预炎症损伤的效应优于单纯头部取穴。