CSFV SM株感染对猪外周血白细胞的影响以及在猪体内的分布

论文摘要

猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fevervirus,CSFV）引起的一种高发病率、高度接触性传染病。急性感染以发病急、高热稽留、脾梗死和外周血白细胞减少为主要特征。本研究运用血常规技术和流式细胞技术分析了CSFV石门株感染无母源抗体断奶仔猪后猪体内外周血白细胞（peripheral blood leucocytes,PBL）亚群变化、SLAⅠ分子和SLAⅡDR分子在PBL中的表达以及PBL细胞凋亡情况,并结合荧光定量PCR技术分析感染后猪体内外周血中CSFV核酸载量变化,同时运用免疫组化和RT-PCR技术分析CSFV感染后各器官中CSFV分布情况,从细胞和分子水平探讨CSFV急性感染对PBL细胞的影响以及CSFV病毒在宿主体内的分布规律。为研究CSFV强毒感染对猪外周血白细胞的影响,用CSFV SM株感染60日龄仔猪后采集猪外周血,运用血常规分析仪和流式细胞仪分析PBL亚群变化、细胞凋亡动态和SLA分子表达动态。结果显示:CSFV感染后可以在24小时内引起PBL的大量减少;除中性粒细胞以外,PBL的减少伴随着所有亚群细胞绝对数量的持续性降低;通过细胞凋亡分析发现,CSFV感染后PBL的减少是通过细胞凋亡的方式进行的,感染后早期凋亡细胞相对含量升高,淋巴细胞和粒细胞分别在1DPI和5DPI形成一个凋亡高峰,早期凋亡细胞分别为15.2%±1.53%和0.1%±7.05%。对外周血中SLA分子表达分析显示,CSFV感染不影响淋巴细胞SLAⅠ和SLAⅡDR分子的表达,但却能在初期抑制粒细胞表达SLAⅠ分子,促进粒细胞表达SLAⅡDR分子,SLAⅡDR+粒细胞在感染后持续升高并在3DPI达到峰值,SLAⅡDR+细胞为53.2%±5.93%,而后持续降低并在6DPI时降到感染前水平。另外运用荧光定量PCR分析外周血中CSFV核酸载量变化情况,结果显示2DPI时能够在血液中检测到CSFV核酸,核酸载量持续升高在6DPI时到达最大值,为2DPI的104.84±0.98倍。上述结果表明,CSFV SM株感染后通过细胞凋亡的方式诱导PBL的大量减少,且PBL的减少与CSFV核酸载量的变化无直接相关性。为研究CSFV感染后在猪体内的分布规律,用CSFV SM株感染60日龄断奶仔猪后采集心、肝、脾、肺、肾、淋巴结、肠等28个体内器官样本和眼分泌物、粪便、尿液和鼻拭子等4个体外样本。运用免疫组化方法分析CSFV在脾脏、肺脏、肝脏、下颌淋巴结、肾脏、十二指肠、扁桃体、肠系膜淋巴结、腹股沟浅淋巴结、回肠、空肠、结肠、胸腺、胃、胰腺、大脑、膀胱、脊髓、回盲瓣、心脏和骨骼肌等21个器官中的分布情况。结果显示在上述21个器官组织中均能观察到CSFV感染细胞,除胰腺、大脑、肾脏、肺脏、膀胱上皮细胞和胃肠道等组织中的部分组织细胞感染CSFV外,CSFV的主要复制场所是免疫组织,包括脾脏、淋巴结、胸腺、扁桃体和肠道相关淋巴组织。同时在脾脏、扁桃体和淋巴结中发现大量的细胞核碎片,细胞核碎片富集区内淋巴小结结构完全改变,这一结果揭示,CSFV SM株感染后可以诱导外周免疫器官中淋巴细胞发生凋亡。运用RT-PCR技术分析所采集的32个样本中CSFV分布情况,结果显示:1DPI时能够在脾脏、下颌淋巴结、腹股沟浅淋巴结、肠系膜淋巴结、空肠和回肠中检测到CSFV核酸;2DPI时检测为阳性的组织增加了扁桃体、十二指肠、直肠、结肠、睾丸（卵巢）、回盲瓣、胸腺、血清、血液（EDTA抗凝外周血）、胰腺、肺和骨髓;3DPI时PCR检测为阳性的组织增加了眼分泌物;4DPI检测为阳性的样本增加鼻拭子、尿液、食道、皮肤（腹部内侧）、肝脏、胃、肌肉（后腿部骨骼肌）、大脑、脊髓、心肌、粪便、膀胱和肾脏,此时能在所有采集的样本中检测到CSFV核酸。CSFV急性感染中,猪感染CSFV后按时间先后顺序可以通过眼分泌物（泪液）、鼻腔、粪便和尿液排毒。免疫组化结果与RT-PCR检测结果基本一致。上述结果均表明,CSFV主要的靶器官和组织是脾脏、淋巴结、胸腺、扁桃体和肠道相关淋巴组织中,在这些器官中感染的主要细胞为淋巴细胞和巨噬细胞。综合以上结果表明,CSFV感染后可通过细胞凋亡的方式引起外周血白细胞各亚群细胞和外周免疫组织中淋巴细胞的大量减少从而影响初期宿主的抗病毒免疫。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 目录
• 第一章 CSFV致病机理研究进展
• 1 CSFV病原特征
• 2 CSFV在全球的流行趋势
• 3 国内CSFV流行现状
• 4 CSFV发病机理研究进展
• 4.1 CSFV在宿主细胞的复制过程
• 4.2 CSFV强毒感染后在宿主体内的分布
• 4.3 CSFV感染在血液中的传播以及对PBL亚群的影响
• 4.4 CSFV感染对骨髓的病理损伤
• 4.5 CSFV感染对脾脏的损伤
• 4.6 CSFV感染对淋巴结和胸腺的损伤
• 4.7.CSFV感染对肠道的损伤
• 4.8 CSFV急性感染对其他组织器官的损伤
• 5 CSFV感染诱发的免疫反应
• 6 本研究的意义
• 7 研究内容和技术路线
• 7.1 研究内容
• 7.2 技术路线
• 第二章 CSFV SM株感染断奶仔猪对外周白细胞的影响
• 1 实验材料
• 1.1 实验动物以及毒株
• 1.2 分子生物学试剂
• 1.3 常规生化试剂及其配制
• 1.4 流式细胞检测用试剂
• 1.5 主要实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 CSFV SM株在猪体上的感染实验
• 2.2 实验猪外周血血常规检测
• 2.3 实验用猪外周血淋巴细胞CD3/4/8三色免疫荧光分析
• 2.4 实验用猪SLA classic Ⅰ和SLA class ⅡDR在PBL中的表达分析
• 2.5 实验用猪外周血白细胞凋亡分析
• 2.6 实验用猪外周血总RNA的提取以及总RNA中CSFV核酸含量的荧光定量PCR检测
• 2.6.1 外周血中总RNA的提取
• 2.6.2 CSFV核酸在外周血中的相对含量测定
• 2.7 数据处理方法
• 3 实验结果
• 3.1 实验猪感染后临床症状
• 3.2 实验用猪感染后血常规测定结果
• 3.3 实验用猪外周血淋巴细胞CD3/4/8三色免疫荧光分析结果
• 3.4 CSFV感染后SLA classic Ⅰ和SLA class ⅡDR分子在PBL中的表达分析
• 3.5 CSFV感染后外周血白细胞凋亡分析
• 3.6 CSFV感染后CSFV核酸在外周血中的动态变化
• 4 讨论
• 5 小结
• 第三章 猪瘟病毒SM株感染断奶仔猪后在猪体内的分布
• 1 实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 实验用毒株
• 1.3 实验用单克隆抗体
• 1.4 主要试剂及其配置
• 1.5 主要实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 动物感染实验
• 2.2 样本采集与固定
• 2.3 石蜡切片的制备
• 2.4 免疫组化实验
• 2.5 各组织样本RNA的提取以及CSFV的PCR检测
• 3 实验结果
• 3.1 免疫组化结果汇总
• 3.2 PCR检测结果
• 4 讨论
• 4.1 关于免疫组化检测结果
• 4.2 关于PCR检测结果
• 4.3 两种方法结果比较
• 5 小结
• 第四章 结论
• 下一步工作设想
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介