论文题目: 天花粉蛋白基因表达载体的构建及转化杨树的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 森林保护学
作者: 邹莉
导师: 王志英,安成才
关键词: 杨树,天花粉蛋白,载体构建,基因转化
文献来源: 东北林业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 杨树在我国分布广泛,种类繁多,繁殖容易,栽培简便,适应性强,生长速度快,材质优良,是用材、防风、绿化的主要造林树种。但杨树的病虫害种类繁多,危害严重,加之长期使用有机化学农药,更给我国的林业生产和生态建设造成了巨大的经济损失。所以,杨树病虫害防治是目前林业生产亟待解决的问题,也是林木遗传育种工作者的首要任务。 天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)是从葫芦科药用植物栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim)块根中分离得到的单链核糖体失活蛋白(Ribosome Inactivating Protein,RIP),能够抗烟草花叶病毒等7种病毒、稻瘟病菌等9种病原真菌及蚜虫等4类害虫。利用基因工程手段,将具有抗病和抗虫特性的天花粉蛋白基因转入杨树,增强杨树抗逆性,使杨树免遭病虫危害,具有无污染,不杀伤天敌,保护生物多样性,维持生态平衡等特点,且意义重大。 本研究构建了含有TCS启动子及结构基因的植物表达载体pC-tPro-TCS-GUS和pC-tPro-TCS,及受PAL(Phenylalanine Ammonia-Lyase)诱导型启动子调控的植物表达载体pC-pPro-2-TCS、pC-pPro-1-TCS-GUS和pC-pPro-1-TCS。pC-tPro-TCS-GUS是在pCambia1381表达载体的GUS报告基因上游嵌合入TCS启动子及结构基因而成。pC-tPro-TCS是在pCambia1301多克隆位点中插入TCS启动子及结构基因,该基因下游不具有GUS报告基因。pC-pPro-2-TCS是在pPPG表达载体的PAL诱导型启动子下游嵌合入TCS基因,TCS基因在串联启动子PAL控制下;在天花粉蛋白基因的起始密码子ATG前12bp处有原载体中的起始密码子ATG,表达后形成了4个融合的氨基酸位于重组天花粉蛋白的N端;TCS基因下游为转录终止信号。pC-pPro-1-TCS和pC-pPro-1-TCS-GUS是将TCS基因插入到pPPG表达载体的PAL启动子的非翻译区与GUS报告基因上游,TCS基因在串联启动子PAL控制下;天花粉蛋白基因的起始密码子与原载体中的起始密码子是同一ATG,在重组天花粉蛋白的N端不会形成融合的氨基酸。在表达载体pC-pPro-1-TCS-GUS中,TCS基因下游没有转录终止信号,具有GUS报告基因;在表达载体pC-pPro-1-TCS中,TCS基因下游有转录终止信号。 将构建好的植物表达载体转化农杆菌LBA4404,提质粒进行特异引物PCR扩增。PCR扩增结果验证了植物表达载体pC-tPro-TCS-GUS、pC-tPro-TCS、pC-pPro-2-TCS、pC-pPro-1-TCS-GUS和pC-pPro-1-TCS都已转入进农杆菌中。以小黑杨(Populus simonii×P.nigra)为材料,采用农杆菌介导法首次将天花粉蛋白基因(TCS)导入杨树,为进一步探讨TCS对杨树病虫害的广谱抗性提供了材料,也为获得更多抗病虫转基因树木奠定了理论基础。
论文目录:
摘要
Abstract
1 绪论
1.1 天花粉蛋白的研究进展
1.1.1 核糖体失活蛋白与天花粉蛋白
1.1.2 天花粉蛋白的分子结构和功能相互关系
1.1.3 天花粉蛋白基因在原核及真核生物中的表达
1.1.4 天花粉蛋白对植物病虫害抗性
1.2 杨树基因工程研究进展
1.2.1 杨树遗传转化
1.2.2 抗性转基因杨树研究进展
1.3 本论文研究的目的和意义
2 栝楼DNA提取及TCS启动子及结构基因的克隆和鉴定
2.1 材料和试剂
2.1.1 植物材料、菌种和载体
2.1.2 药品及试剂
2.1.3 主要仪器
2.2 研究方法
2.2.1 植物总DNA的提取——采用CTAB法
2.2.2 具有TCS启动子及结构基因植物表达载体pC-tPro-TCS-GUS的构建
2.2.3 含有TCS启动子及结构基因的植物表达载体pC-tPro-TCS的构建
2.3 结果与分析
2.3.1 含有TCS启动子及结构基因植物表达载体pC-tPro-TCS-GUS的构建
2.3.2 含有TCS启动子及结构基因的植物表达载体pC-tPro-TCS的构建
2.4 小结
2.4.1 含有TCS启动子及结构基因植物表达载体pC-tPro-TCS-GUS的构建
2.4.2 含有TCS启动子及结构基因的植物表达载体pC-tPro-TCS的构建
2.4.3 表达载体pC-tPro-TCS-GUS与pC-tPro-TCS
3 受PAL诱导型启动子调控的TCS表达载体的构建
3.1 材料和试剂
3.1.1 菌种和载体
3.1.2 药品及试剂
3.2 研究方法
3.2.1 植物表达载体pC-pPro-2-TCS的构建
3.2.2 植物表达载体pC-pPro-1-TCS-GUS和pC-pPro-1-TCS的构建
3.3 结果与分析
3.3.1 植物表达载体pC-pPro-2-TCS的构建
3.3.2 植物表达载体pC-pPro-1-TCS-GUS和pC-pPro-1-TCS的构建
3.4 小结
3.4.1 植物表达载体pC-pPro-2-TCS的构建
3.4.2 植物表达载体pC-pPro-1-TCS-GUS和pC-pPro-1-TCS的构建
3.4.3 载体pC-pPro-2-TCS与pC-pPro-1-TCS-GUS和pC-pPro-1-TCS
4 植物表达载体的农杆菌转化及转基因杨树的再生
4.1 材料和试剂
4.1.1 植物材料、菌种和载体
4.1.2 药品及试剂
4.1.3 培养基
4.2 研究方法
4.2.1 农杆菌感受态细胞的制备
4.2.2 植物表达载体的农杆菌转化
4.2.3 阳性菌落的鉴定
4.2.4 农杆菌转化杨树及杨树的再生
4.3 结果与分析
4.3.1 植物表达载体转化农杆菌
4.3.2 农杆菌转化杨树
4.4 小结
结论与讨论
今后设想
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
发布时间: 2005-10-21
参考文献
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