对虾肠道益生菌对凡纳滨对虾非特异免疫力和抗病力影响的研究

论文摘要

高密度集约化的对虾养殖业在世界范围内兴起,由对虾自身和外界环境引起的各种细菌性、病毒性疾病严重制约了该产业的持续健康发展,同时也带来了严重的经济损失。在此背景下各种措施应运而生,但抗生素,消毒剂和杀虫剂等治病的传统方法得到了质疑,可替代方法在不断探索之中,提高机体自身免疫力和抗病力是解决这一难题的重要思路之一。近年来益生菌作为控制水产养殖疾病的可替代途径引起热议,相关报道从益生菌应用的良好效果,无污染和安全性等方面均做了细致研究。本论文将分离自健康对虾肠道的几株益生菌进行不同的配伍添加在对虾基础饲料中,以观察其对对虾非特异性免疫力和抗病毒能力的影响,同时进行了部分分子生物学分析以期为益生菌的作用机理提供一定的理论基础。主要研究内容和结果分以下几方面:1、坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）,美人鱼发光杆菌（Photobacterium damselae）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）不同配伍对凡纳滨对虾部分非特异性免疫酶活性和抗病力的影响:坚强芽孢杆菌活菌（不少于1.0×108CFU/g饲料）分别与美人鱼发光杆菌（1%）和溶藻弧菌（1%）灭活菌配伍后加入基础饲料作为免疫饲料。以基础饲料为对照组,整个实验过程采取间隔投喂（之前被验证为效果较好的投喂方式）。免疫15d后进行WSSV病料（感染量0.9g/10尾）人工投喂感染,感染时间为15d。实验期间每5d采集各实验组对虾血淋巴,处理后用于超氧化物歧化酶（SOD）、碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、一氧化氮合酶（NOS）和溶菌酶（UL）活力的测定。感染后每天记录对虾死亡数,并统计对照组和实验组的累计死亡率。结果表明,各免疫组超氧化物歧化酶（SOD）、碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、一氧化氮合酶（NOS）活性整体上均显著高于对照组,但饲料中添加益生菌对溶菌酶活性物显著影响。累计死亡率结果表明:添加坚强芽孢杆菌和美人鱼发光杆菌混合组的抗病毒能力最强（10.71%）,显著高于对照组（64.28%）,其次是坚强芽孢杆菌和溶藻弧菌混合组。研究结果证实:在饲料中添加益生菌可显著提高凡纳滨对虾非特异性免疫酶活性和抗病毒能力,其中尤以坚强芽孢杆菌和美人鱼发光杆菌的复合菌组效果最佳。2、坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）,美人鱼发光杆菌（Photobacterium damselae）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）不同配伍对凡纳滨对虾肠道消化酶活性和肠道菌群的影响:按第一部分中进行配伍后制备免疫饲料,实验分组和处理同前。实验期间每5d无菌条件下取对虾肠道匀浆,一部分用于消化酶（胃蛋白酶,淀粉酶和脂肪酶）活性的测定,一部分进行梯度稀释后涂布2216E固体培养基进行细菌菌落计数。结果表明,饲料中添加益生菌的免疫组对胃蛋白酶,淀粉酶和脂肪酶均表现出一定的规律性,在免疫阶段和感染阶段整体上都是先上升后下降,且这个实验阶段的最大值一般出现在实验25d,在实验结束时又大体回落至实验初期水平。整个实验期间各免疫组的消化酶活多数阶段均显著高于对照组（P<0.05）。这种规律变化说明饲料中添加的益生菌对凡纳滨对虾的肠道具有调节作用,由免疫期间的先上升后下降可以看出益生菌的这种调节作用并不是无限增加的。在感染阶段,出现先上升后下降的趋势,说明益生菌对病毒感染能做出相应反应,但其反应也不是持续不变的。在肠道菌群变化上,坚强芽孢杆菌和美人鱼发光杆菌混合菌组的可培养细菌总数和优势菌总数显著高于对照组（P<0.05）,其余免疫组差异不显著（P>0.05）。以上结果表明,饲料中添加肠道益生菌可显著改善对虾肠道消化酶活性并对肠道菌群有一定调节作用,这与益生菌在宿主体内发挥作用的主要途径是一致的。3、坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）,美人鱼发光杆菌（Photobacterium damselae）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）不同配伍对凡纳滨对虾部分免疫相关基因表达量的影响:实验以基础饲料为对照组,以添加坚强芽孢杆菌活菌（不少于1.0×108CFU/g饲料）和美人鱼发光杆菌（1%）和溶藻弧菌（%）的饲料为免疫组。每组3个重复,实验期间进行间隔投喂。每5d取各实验组10-15尾对虾抽取血淋巴离心后收集血细胞用于RNA的提取,以β-actin为内参基因,对凡纳滨对虾STAT基因,超氧化物歧化酶（SOD）基因和酚氧化酶原（proPO）基因用Rotor-gene 3000进行实时定量PCR扩增,用2-ΔΔCT法进行各基因mRNA相对表达量的分析。结果表明,在饲料中添加益生菌对酚氧化酶原（proPO）基因的相对表达有一定影响但并不显著高于对照组,对STAT和超氧化物歧化酶（SOD）基因的相对表达几乎没有影响。4、4株对虾环境共生菌对凡纳滨对虾益生作用的研究:实验旨在探究分离自健康凡纳滨对虾消化道和养殖水体的几株细菌:微小杆菌（Microbacterium spp）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）、溶藻胶弧菌（Vibrio alginolyticus）与蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）对凡纳滨对虾的益生作用。将上述菌株单一或者复合后加入基础饲料配制免疫饲料,以基础饲料为对照组,每组三个重复,对个体质量为（6.1±0.2）g的凡纳滨对虾进行为期30d的养殖实验。每5d取样,以血清中的碱性磷酸酶（AKP）、一氧化氮合酶（NOS）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（UL）和酚氧化酶（PO）活性为免疫指标,探讨了对虾环境共生菌作为饲料添加剂对凡纳滨对虾非特异性免疫水平的影响;在投喂免疫饲料后的第16d,按1.00g/10尾的剂量,直接投喂感染白斑综合征病毒（WSSV）对虾病料,计算各实验组累计死亡率,分析对虾环境共生菌作为饲料添加剂对凡纳滨对虾抗病毒感染能力的影响。实验结果显示:添加细菌的免疫组对虾血清中SOD、PO、AKP、UL和NOS活性均未明显高于对照组,且有部分免疫组的免疫相关酶活低于对照组;各免疫组对凡纳滨对虾抗WSSV感染的能力也无显著提高。以上结果表明:本实验中在饲料中添加的4株细菌并未能提高凡纳滨对虾非特异性免疫水平和抵抗疾病的能力,暂不将其作为对虾免疫增强剂候选菌株。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 第一章 综述益生菌在水产养殖中的应用研究进展
• 前言
• 1 益生菌的定义及生物学功能
• 1.1 定义
• 1.2 生物学功能
• 2 条件和菌种
• 2.1 益生菌菌株的条件以及质量特点
• 2.2 菌种
• 3 益生菌的作用机制
• 3.1 抑制病原菌感染宿主
• 3.2 竞争排斥
• 3.3 营养作用
• 3.4 刺激机体免疫系统，提高机体免疫力
• 3.5 改善水质
• 4 益生菌在水产养殖中的应用
• 4.1 鱼类
• 4.2 虾蟹类
• 4.3 贝类
• 4.4 饵料生物
• 5 益生菌的鉴定、筛选与生产
• 5.1 菌株的鉴定
• 5.2 水产养殖中益生菌的筛选
• 5.3 生产方法
• 6 研究热点
• 6.1 定殖和粘附——微生物群落可控性
• 6.2 单一制剂和复合制剂
• 6.3 益生菌的作用因子
• 6.4 益生菌与其它物质的协同作用
• 6.5 益生菌的有效性和安全性
• 6.6 体外与体内实验结果的一致性
• 7 展望
• 参考文献
• 第二章 几株肠道益生菌对凡纳滨对虾非特异性免疫功能和抗病力的影响
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 样品采集与处理
• 1.3 对虾非特异性免疫相关酶活性的测定
• 1.4 WSSV 感染实验
• 1.5 统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 益生菌对凡纳滨对虾血清中超氧化物歧化酶（SOD）的影响
• 2.2 益生菌对凡纳滨对虾血清中碱性磷酸酶（AKP）的影响
• 2.3 益生菌对凡纳滨对虾血清中酸性磷酸酶（ACP）的影响
• 2.4 益生菌对凡纳滨对虾血清中总一氧化氮合酶（TNOS）的影响
• 2.5 益生菌对凡纳滨对虾血清中诱导性一氧化氮合酶（iNOS）的影响
• 2.6 益生菌对凡纳滨对虾血清中溶菌酶（UL）的影响
• 2.7 感染实验结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 益生菌对凡纳滨对虾肠道消化酶和菌群的影响
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 指标测定
• 1.3 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 益生菌对凡纳滨对虾肠道消化酶活性的影响
• 2.2 益生菌对凡纳滨对虾肠道细菌数量的影响
• 3 讨论
• 3.1 肠道益生菌与肠道消化酶活性
• 3.2 肠道益生菌与肠道菌群变化
• 参考文献
• 第四章 复合益生菌对凡纳滨对虾部分非特异免疫相关基因表达量的影响
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 样品采集与处理
• 1.3 总RNA 提取、纯化及反转录
• 1.4 Real time PCR
• 1.5 结果分析
• 2 结果
• 2.1 cDNA 质量
• 2.2 RT-PCR 扩增的溶解曲线分析
• 2.3 信号转导及转录激活因子（STAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和酚氧化酶（proPO）基因的相对表达分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第五章 4 株对虾环境共生菌对凡纳滨对虾益生作用的研究
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 样品采集与处理
• 1.3 对虾非特异性免疫相关酶活性的测定
• 1.4 WSSV 感染实验
• 1.5 统计分析
• 2 结果
• 2.1 4 株对虾环境共生菌对凡纳滨对虾血清中酚氧化酶（PO）活性的影响
• 2.2 4 株对虾环境共生菌对凡纳滨对虾血清中超氧化物歧化酶（SOD）的影响
• 2.3 4 株对虾环境共生菌对凡纳滨对虾血清中碱性磷酸酶（AKP）的影响
• 2.4 4 株对虾环境共生菌对凡纳滨对虾血清中总一氧化氮合酶（TNOS）的影响
• 2.5 4 株对虾环境共生菌对凡纳滨对虾血清中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的影响
• 2.6 4 株对虾环境共生菌对凡纳滨对虾血清中溶菌酶（UL）的影响
• 2.7 感染实验结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 个人简历
• 发表的学术论文
• 致谢